基于磷脂脂肪酸剖析不同老熟方法的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)

劉琨毅，王 琪*，周書來，吳冬梅，龍治國

（1.宜賓職業(yè)技術學院 五糧液技術學院，四川 宜賓 644003；2.樂山職業(yè)技術學院藥學系，四川 樂山 614000；3.瀘州職業(yè)技術學院 白酒學院，四川 瀘州 646005；4.宜賓縣吉鑫制酒有限責任公司，四川 宜賓 644000）

川派濃香型白酒因其獨特的混蒸混燒、續(xù)糟配料、泥窖發(fā)酵的釀造工藝而使棲息在其中的微生物長期處于高酸和無氧的極端環(huán)境中，而微生物又在其釀造過程中發(fā)生了協(xié)同的生化反應及產(chǎn)生了獨特的調(diào)控方式，這賦予了川派濃香型白酒獨特的風格特點[1-6]。濃香型白酒生產(chǎn)過程中所需的微生物主要生長在窖池窖泥中，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響著濃香型白酒的質(zhì)量[7]。新窖產(chǎn)酒一般酒質(zhì)較差，而老窖窖泥在長期生產(chǎn)與馴化過程中，逐漸富集了大量與釀酒有關的各類功能微生物，因此，老窖出好酒[8-9]。

為了縮小新窖與老窖酒質(zhì)之間的差距，新窖老熟便應運而生[10]。如何在短時間內(nèi)使新窖窖泥達到老窖窖泥的水平并生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)白酒，許多酒類企業(yè)陸續(xù)根據(jù)自己的實際情況，設計出了新窖老熟的各種制備方法[11-12]。如何在眾多方法中快速而有效地尋找到適合川派濃香型白酒窖池的方法是近年來研究的熱點[17]。目前，應用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)的快速分析方法主要有以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術為核心的現(xiàn)代分子生物學方法、Biolog法、生化指紋圖譜法等免培方法[9]。但由于PCR擴增容易受到引物特異性及微生物群落結(jié)構(gòu)復雜等因素的影響，Biolog法僅能粗略反映群落結(jié)構(gòu)特征及動態(tài)變遷規(guī)律，所以兩種方法都難以全面剖析窖泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)特征及動態(tài)變遷規(guī)律[13]。磷脂脂肪酸（phos-pholipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜技術是一種研究微生物群落結(jié)構(gòu)的快捷方法[14]，已成功應用于濃香型白酒釀造窖池等復雜體系的微生物群落及動態(tài)變遷規(guī)律的研究[15-17]。本研究采用PLFA技術分析3種常見的窖泥老熟方法的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)，以期尋找到適合川派濃香型白酒釀造窖池快速有效的窖泥老熟方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新窖窖泥（呈黃色、黏性大、無香味）、50年以上窖齡窖池窖泥（表層呈灰白色，內(nèi)層呈烏黑色；質(zhì)感濕潤、無粘稠性；香氣協(xié)調(diào)，有明顯的硫化氫氣味和氨氣味。上層，O1；中層，O2；下層，O3）、50年以上窖齡窖池生產(chǎn)的酒醅、窖皮窖泥、黃水、酒尾、大曲粉：宜賓J酒廠。

1.1.2 試劑

檸檬酸、檸檬酸鈉、氯仿、丙酮、甲苯、醋酸、氫氧化鉀、尿素、過磷酸鈣（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純）：德國Darmstadt公司。

1.2 儀器與設備

PHs-3c型精密pH計：上海理達儀器廠；BS210S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-ZK型恒溫水浴鍋：上海衛(wèi)凱儀器設備有限公司；ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；MD200-1型氮氣吹掃儀：杭州奧盛儀器有限公司；QP2010型氣-質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC）儀：日本島津公司；TR-5MS型色譜柱（30.0 m×320μm×0.25μm）：美國Thermo公司；SPE型硅膠層析小柱（3 mL，250 mg）：德國Hardwee公司；Sherlock 6.0微生物鑒定系統(tǒng)：美國MIDI公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥老熟方法

窖泥老熟方法A：分別將1 600 kg 50年以上窖齡窖池窖泥的窖壁上層、中層和下層窖泥與1 600 kg窖皮窖泥、225 kg黃水、50 kg大曲粉、6 kg尿素、30 kg過磷酸鈣、15 kg酒尾（酒精度＜40%vol）充分拌勻并自然堆積發(fā)酵15 d，在新窖窖池窖底鋪上厚度為25 cm經(jīng)堆積發(fā)酵后的下層窖泥，窖壁的不同位置分別用力甩上厚度為20 cm的對應位置經(jīng)堆積發(fā)酵后的窖泥并抹平。

窖泥老熟方法B：將50年以上窖齡窖池生產(chǎn)的酒醅按照濃香型白酒跑窖法[18]拌曲后入新窖窖池（傳統(tǒng)人工窖泥的新窖）發(fā)酵。

窖泥老熟方法C：將方案A中經(jīng)堆積發(fā)酵后的窖泥（分為窖壁上層、中層和下層窖泥），分別使用到新窖窖池對應的窖層中，并采用方案B中的酒醅入窖方式釀酒。

1.3.2 窖泥取樣方法

距窖口50 cm均勻取樣為上層窖泥，距窖底50 cm均勻取樣為中層窖泥，窖池底部均勻取樣為下層窖泥，共取得36份樣品，所有的樣品均在3 h內(nèi)完成預處理。窖泥樣品具體信息如表1所示。

表1 窖泥樣品編號Table 1 Code of pit mud samples

1.3.3 PLFA的分析方法

（1）窖泥的預處理

分別準確稱取窖泥5.0 g，加入30 mL檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.0），渦旋振蕩10 min后經(jīng)4層無菌紗布過濾，其濾清液經(jīng)2 500 r/min離心15 min，取上清液，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。檸檬酸緩沖液重復洗滌3次后備用，上述樣品均設3個重復。

（2）PLFA的提取

在上述沉淀中加入19 mL檸檬酸緩沖液、甲醇與氯仿（0.8∶2.0∶1.0，V/V）的混合液，避光振蕩2 h，加入10 mL檸檬酸緩沖液與氯仿（1∶1，V/V）的萃取溶劑，靜置避光萃取24 h，收集氯仿相，利用氮吹儀吹干樣品；5 mL氯仿溶解干燥樣品后，加入提前經(jīng)氯仿浸潤的硅膠層析小柱內(nèi)，依次采用10 mL氯仿、10 mL丙酮、10 mL甲醇進行洗脫，收集甲醇相，并用氮氣吹干燥[16-17]，即為PLFA。

（3）PLFA的甲基化

利用1 mL甲苯與甲醇（1∶1，V/V）的混合液溶解PLFA，加入1 mL氫氧化鉀-甲醇溶液（0.2 mol/L），37℃水浴保溫30 min，用1 mol/L乙酸溶液將pH調(diào)至6.0，加正己烷和超純水各2 mL，漩渦振蕩5 min，將有機相移入潔凈樣品瓶中，氮氣吹干待測[4-5]。

（4）PLFA的氣相色譜分析

TR-5MS型色譜柱（30.0 m×320μm×0.25μm），進樣口溫度：250℃，分流比：10∶1，載氣：氦氣（He），流速：1 mL/min，進樣量：0.5μL。升溫程序：起始柱溫40℃，保持2min；再以5℃/min升至220℃，保持9 min。電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：35～400 amu[14-15]。

（5）PLFA的微生物群落表征

磷脂脂肪酸（PLFA）的命名參考鄭佳等[3]的命名方法，PLFA的通式用X：YωZ表示，其中X代表脂肪酸甲酯主鏈上的總碳原子數(shù)，Y表示不飽和雙鍵的數(shù)目，ω代表含有雙鍵，Z代表雙鍵距甲基末端的位置。測定結(jié)果為i13：0、a14：0、i15：0、a15：0、a16：0和i16：0代表革蘭氏陽性菌；16：1ω5c、16：1ω7c、16：1ω9、cy17：0和18：1ω6代表革蘭氏陰性菌；15：0、i16：0、i17：0代表好氧菌；cy17：0、cy19：0代表厭氧菌；18：3ω6，9，12、18：2ω6，9和18：lω9代表真菌。其中前綴i表示PLFA中含有異構(gòu)甲基支鏈，a表示PLFA中含有反異構(gòu)甲基支鏈，cy代表含有環(huán)丙基。1.3.4濃香型白酒出酒率的計算

式中：蒸餾酒總質(zhì)量需換算成酒精濃度50%vol的質(zhì)量。

1.3.5 濃香型白酒感官評定

由7名四川省白酒評委組成的感官評定組，在環(huán)境幽靜、空氣流通、光線充足的品酒室，按照濃香型白酒的感官評定標準[19-20]進行感官評定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用美國MIDI公司開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock6.0系統(tǒng)進行PLFA的鑒定和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)三輪次發(fā)酵后不同窖泥老熟方法窖泥PLFA指紋圖譜的比較

采用3種不同窖泥老熟方法對窖泥進行三輪次發(fā)酵，窖泥的PLFA氣相色譜圖見圖1，窖泥的PLFA含量見圖2。

圖1 3種不同老熟方法窖泥的磷脂脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of phospholipid fatty acid in pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

圖2 3種不同老熟方法上層（a）、中層（b）和下層（c）窖泥中磷脂脂肪酸含量Fig.2 Phospholipid fatty acid contents in the upper(a),middle(b)and lower(c)layer of pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

由圖1和圖2可知，經(jīng)三輪次發(fā)酵后，在3種不同窖泥老熟方法窖泥中，C8～C20的PLFA 26種，其中直鏈飽和脂肪酸（linear saturated fatty acids，LSFA）5種、支鏈飽和脂肪酸（branched saturated fatty acids，BRFA）14種、環(huán)丙基脂肪酸（cyclopropyl fatty acids，CPFA）2種、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）4種、多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）1種。

由圖2a可知，在3種不同窖泥老熟方法老熟的上層窖泥中，C8～C20的PLFA 19種，其中LSFA 5種、BRFA 10種、CPFA 1種、MUFA 2種、PUFA 1種。其中，在方法C老熟的上層窖泥中，PLFA總含量最高，為（47.26±3.57）nmol/g，其次為方法B老熟的上層窖泥，為（33.14±2.53）nmol/g，在方法A老熟的上層窖泥中PLFA總含量最低，為（29.70±2.35）nmol/g。

由圖2b可知，在3種不同窖泥老熟方法老熟的中層窖泥中，C8～C20的PLFA26種，其中在窖泥樣品A32中未檢出10Me16：0與17：0，在窖泥樣品B32中未檢出a9：0、α-OH-10：0、10Me16：0、10Me18：0與20：1ω6。在方法C老熟的中層窖泥中PLFA總含量最高，為（57.22±2.35）nmol/g，在方法A老熟的中層窖泥中PLFA總含量其次，為（35.14±1.72）nmol/g，在方法B老熟的中層窖泥中PLFA總含量最低，為（34.17±1.47）nmol/g。

由圖2c可知，在3種不同窖泥老熟方法下層窖泥中，C8～C20的PLFA 26種，其中在窖泥樣品A33中未檢出a15：0與17：0，在窖泥樣品B33中未檢出a9：0、α-OH-10：0、10Me16：0、10Me18：0與20：1ω6。在方法C老熟的下層窖泥中PLFA總含量最高，為（70.27±2.66）nmol/g，在方法A老熟的下層窖泥中PLFA總含量其次，為（44.66±1.94）nmol/g，在方法B老熟的下層窖泥中PLFA總含量最低，為（38.09±1.73）nmol/g。

經(jīng)三輪次發(fā)酵后，3種老熟方法不同泥層窖泥中PLFA總含量均為下層最高，分別為A33：（44.66±1.94）nmol/g；B33：（38.09±1.73）nmol/g；C33：（70.27±2.66）nmol/g，中層其次，分別為A32：（35.14±1.72）nmol/g；B32：（34.17±1.47）nmol/g；C32：（57.22±2.35）nmol/g，上層最低，分別為A31：（29.70±2.35）nmol/g；B31：（33.14±2.53）nmol/g；C31：（47.26±3.57）nmol/g。這表明窖泥微生物的數(shù)量從窖池上層向下層逐漸增多，可能是由于窖池中的釀酒微生物在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量的菌體自溶物、腐殖質(zhì)、有機酸等營養(yǎng)物質(zhì)，隨黃水逐漸滲透到窖池的底部，使釀酒微生物能夠更好地生長繁殖[20]。

2.2 不同窖泥老熟方法對窖泥特征PLFA圖譜的影響

由圖3a可知，在使用窖泥老熟方法A的上層窖泥中，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及厭氧菌的含量均隨著釀酒輪次的增加而增加，并逐漸趨近于50年以上窖齡窖池上層窖泥（O1）革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及厭氧菌含量；好氧菌及真菌的含量則隨著釀酒輪次的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，但也逐漸趨近于O1，這可能是由于使用方法A所制得的上層窖泥中含有一些不適合釀酒生產(chǎn)環(huán)境的好氧菌及真菌，其在投入生產(chǎn)過后逐漸消亡。由圖3b與圖3c可知，同樣是在使用方法A老熟的中層及下層窖泥所含的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌、真菌的含量均隨著釀酒輪次的增加而增加，并逐漸趨近于50年以上窖齡窖池中層窖泥（O2）及50年以上窖齡窖池下層窖泥（O3）的含量。

圖3 3種不同老熟方法上層窖泥的各類型微生物含量Fig.3 Content of each type of microbes in the upper layer of pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

由圖4a可知，在使用窖泥老熟方法B的上層窖泥中，革蘭氏陽性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的含量隨著釀酒輪次的增加而增加，其中好氧菌、厭氧菌及真菌的含量逐漸趨近于O1；革蘭氏陰性菌的含量則隨著釀酒輪次的增加而減少，其含量也未呈現(xiàn)出逐漸接近于O1的趨勢。由圖4b可知，在方法B老熟的中層窖泥中，革蘭氏陽性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的含量隨著釀酒輪次的增加而增加，并逐漸趨近于O2；革蘭氏陰性菌的含量則隨著釀酒輪次的增加而減少，并逐漸低于O2中革蘭氏陰性菌的含量（1.63±0.20）nmol/g，表明使用方法B老熟的中上層和中層的窖泥里含有有益于釀酒的革蘭氏陰性菌在釀酒過程的前三輪中并未顯著生長。由圖4c可知，在方法B老熟的下層窖泥中，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌、真菌的含量均隨釀酒輪次的增加而增加，并逐漸接近于O3的含量。

圖4 3種不同老熟方法中層窖泥的各類型微生物含量Fig.4 Content of each type of microbes in the middle layer of pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

由圖5a～5c可知，在使用窖泥老熟方法C的上、中、下層的窖泥中，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的含量均隨著釀酒輪次的增加而增加，也逐漸趨近于50年以上窖齡窖池窖泥中所對應的微生物含量。這表明窖泥老熟方法C優(yōu)于方法A及方法B。

圖5 3種不同老熟方法下層窖泥的各類型微生物含量Fig.5 Content of each type of microbes in the lower layer of pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

2.3 不同窖泥老熟方法對窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)特征的影響

由圖6a可知，經(jīng)三輪次發(fā)酵后，50年以上窖齡窖池上層窖泥（O1）中，革蘭氏陽性菌相對于其他3種上層窖泥的百分含量最低（30.22%），而革蘭氏陰性菌相對于其他3種上層窖泥的的百分含量最高（2.42%），這可能是由于老窖池在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，微生物產(chǎn)生的有機酸和醇類等物質(zhì)逐漸積累形成了高酸度、高乙醇的微生態(tài)環(huán)境，使得其中的微生物之間進行優(yōu)勝劣汰；好氧菌及厭氧菌的百分含量在4種樣品中差異不顯著；而真菌的百分含量在上層窖泥C31與O1中均顯著高于A31與B31，表明A31與B31中適合釀酒生產(chǎn)的真菌還需要進一步生長繁殖；C31與O1中革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的百分含量相對接近，達到了窖泥快速老化的目的。

圖6 3種不同老熟方法窖泥中各類型微生物的百分含量Fig.6 Percent content of each type of microbes in pit mud prepared by 3 kinds of aging methods

由圖6b可知，經(jīng)三輪次發(fā)酵后，在4種中層窖泥樣品中，C32與O2的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的百分含量相對接近；A32與O2相比，其革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌及真菌的百分含量差異較為顯著；B32與O2相比，其革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌的百分含量差異較為顯著。這表明經(jīng)過三輪次的濃香型白酒生產(chǎn)，方法C所制得的中層窖泥優(yōu)于方法A與方法B。

由圖6c可知，經(jīng)三輪次發(fā)酵后，在4種下層窖泥樣品中，厭氧菌的百分含量均＞45%，好氧菌的百分含量均＜13%，這表明窖池下部含氧量極低，微生物在窖池中不同位置的生長繁殖受氧氣的脅迫差異明顯；C33與O3中革蘭氏陰性菌及真菌的百分含量均高于A33與B33，而革蘭氏陽性菌與厭氧菌則相反的，這可能由于老窖池在長期釀造過程中，釀酒微生物產(chǎn)生了大量的有機酸、菌體自溶物、腐殖質(zhì)等物質(zhì)，并隨生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的黃水逐漸滲透到窖池的底部，使窖池下層的微生物生長繁殖呈現(xiàn)出有別與上層、中層不同的特征；在3種不同的窖泥老熟方法中，只有使用方法C的下層窖泥其革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的百分含量與O3相對接近。

綜上，經(jīng)過三輪次發(fā)酵的窖泥，在使用方法C老熟的窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)特征與50年以上窖齡窖池的相似，故使用方法C所制得的窖泥優(yōu)于方法A與方法B。

2.4 不同窖泥老熟方法對濃香型白酒出酒率及感官特征的影響

表2 不同老熟方法濃香型白酒的出酒率Table 2 Liquor yield of strong-flavor Baijiu prepared by different aging methods

由表2可知，經(jīng)三輪次發(fā)酵后，使用窖泥老熟方法C的窖池，其白酒出酒率在3種窖泥老熟方法中最高，為（36.52±0.67）%，窖泥老熟方法A的窖池出酒率其次，為（34.05±0.56）%。使用窖泥老熟方法A的窖池所生產(chǎn)的濃香型白酒窖香明顯、酒體較綿甜、味長、尾較凈；使用窖泥老熟方法B的窖池所生產(chǎn)的濃香型白酒具有一定的窖香、酒體較綿甜、稍沖、味長、尾較凈；使用窖泥老熟方法C的窖池所生產(chǎn)的濃香型白酒窖香濃郁、酒體豐滿、入口醇甜、味長、尾凈。經(jīng)過感官品評后發(fā)現(xiàn)，使用窖泥老熟方法C的窖池產(chǎn)酒優(yōu)于窖泥老熟方法A和B的窖池。

3 結(jié)論

優(yōu)良的窖池環(huán)境對濃香型白酒的香味和品質(zhì)有著極為重要的影響，本試驗基于PLFA剖析3種不同窖泥老熟方法所制得的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，使用方法C制得的窖泥經(jīng)三輪次釀酒生產(chǎn)后，其中的微生物多樣性較方法A與方法B豐富，且特征PLFA的種類與50年以上窖齡窖池相同；微生物含量也高于方法A與方法B，并接近于50年以上窖齡窖池的含量；微生物群落結(jié)構(gòu)特征與50年以上窖齡窖池的相似度最高。使用窖泥老熟方法C的窖池所生產(chǎn)的濃香型白酒出酒率最高，為（36.52±0.67）%，窖香濃郁、酒體豐滿、入口醇甜、味長、尾凈。故使用方法C所制得的窖泥優(yōu)于方法A與方法B，但與50年以上窖齡窖池窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)還有一定的差距，需要借助于高通量測序等微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法將窖池中的微生物確定到種屬水平后進行深入研究，以期達到進一步優(yōu)化窖泥老熟方法的目的。