一株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的分離鑒定及其產(chǎn)胞外多糖的研究

黃承敏，肖 茜，王蓉蓉，劉成國(guó)，姚 慧，周 輝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南南山牧業(yè)有限公司，湖南 城步 422512）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類(lèi)能夠利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱(chēng)，作為公認(rèn)安全的益生菌，乳酸菌可促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)，對(duì)腹瀉、腸易激癥、過(guò)敏、乳糖不耐癥、刺激反應(yīng)等均有一定的功效[1]，因而在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。而許多乳酸菌的益生作用與其所產(chǎn)生的胞外多糖有著密切的關(guān)系。乳酸菌胞外多糖（lactic acid bacteria-exopolysaccharide，LAB-EPS）是一些特殊微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外、滲透到培養(yǎng)基中、易與菌體分離的一類(lèi)多糖類(lèi)化合物，對(duì)微生物的生長(zhǎng)有重要意義[2-3]。

胞外多糖是一種由重復(fù)單元和分支所組成的高分子量多糖，在保護(hù)微生物抵御脫水、營(yíng)養(yǎng)缺乏、有毒物質(zhì)、噬菌體、滲透壓和拮抗物等不利條件時(shí)有重要作用[4]。諸如黃原膠、硬葡聚糖、結(jié)冷膠、熱凝多糖、右旋糖苷、短梗霉多糖、細(xì)菌纖維素等胞外多糖都已經(jīng)成功地應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、制藥、化妝品及石油行業(yè)中[5-6]。根據(jù)存在位置的不同，LAB-EPS可以分為兩種：莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）和粘多糖（slimepolysaccharide，SPS），但這兩種多糖因?yàn)榻Y(jié)合在一起很難區(qū)分而統(tǒng)稱(chēng)為胞外多糖[7-8]。從化學(xué)組成上，乳酸菌胞外多糖可分為同型多糖（homopolysaccharides，Ho PS）和雜多糖（heteropolysaccharides，He PS）兩種類(lèi)型，在過(guò)去的10年里，Ho PS是研究最為廣泛的一類(lèi)LAB-EPS[9-10]。近年來(lái)，胞外多糖已成為乳酸菌資源開(kāi)發(fā)利用中的研究熱點(diǎn)，但是由于某些產(chǎn)胞外多糖微生物的產(chǎn)量較低，胞外多糖的應(yīng)用受到限制，所以提高微生物胞外多糖產(chǎn)量至關(guān)重要。目前，通過(guò)優(yōu)良高產(chǎn)菌株的篩選、改良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件等方法能在一定程度上提高微生物胞外多糖的產(chǎn)量[11-12]。

剁辣椒屬于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，其傳統(tǒng)加工方法是利用乳酸菌的自然發(fā)酵和食鹽保存作用進(jìn)行加工處理，目前從剁辣椒中分離出的乳酸菌主要是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（P ediococcus pentosaceus）等，但主要以乳桿菌為主[13-15]。本研究旨在從自然發(fā)酵剁辣椒中篩選出高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株，利用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并初步探討了不同碳源、時(shí)間對(duì)乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

自然發(fā)酵剁辣椒：食品微生物實(shí)驗(yàn)室自制，制作方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1 L，pH 6.4、121 ℃滅菌15 min。

MRS液體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.1.3 試劑

硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、三氯乙酸等：均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭患?xì)菌基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限（北京）有限公司；

1.2 儀器與設(shè)備

TF-FD-1L冷凍干燥機(jī)：上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司；HR/T16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；GZ-400-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；AG 22331 Hamburg聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

稱(chēng)量25 g自然發(fā)酵的剁辣椒，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，搖勻并制備梯度稀釋液，吸取合適稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于MRS固體平板，37℃培養(yǎng)48 h。觀察并記錄菌落特征。用無(wú)菌移液器槍頭輕輕挑取單菌落，觀察有無(wú)連續(xù)的拉絲。將有連續(xù)拉絲的單菌落挑取至MRS平板上進(jìn)行劃線純化，純化得到的單菌落進(jìn)行保存。

1.3.2 胞外多糖的提取及測(cè)定

（1）胞外多糖的提取[16]

將初篩得到的菌株Y-20活化后，轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min、4℃離心10 min，去菌體，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加80%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）至終濃度為10%，充分?jǐn)嚢韬箪o置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液移至燒杯中，加3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4℃醇沉過(guò)夜，多糖呈絮狀沉淀析出，于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，去上清，將沉淀溶于10 mL蒸餾水中，裝入透析袋，透析2 d，每8 h換一次水，得胞外粗多糖水溶液。

（2）胞外多糖的測(cè)定[17]

取25 mL帶塞試管，分別吸取100μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL于每支試管中，蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，然后分別加入2 mL 6%苯酚溶液，搖勻，然后迅速加入濃硫酸10 mL，立即搖勻，室溫靜置30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各反應(yīng)液的吸光度值，以葡萄糖系列質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在帶塞試管中加入胞外粗多糖水溶液2 mL，另取2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，然后分別加入6%苯酚溶液2 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸10 mL，立即搖勻，室溫靜置30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各溶液的吸光度值，按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算胞外多糖的含量。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察

將篩選得到的菌株純化后轉(zhuǎn)接至MRS固體培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)、大小、透明度、色澤、致密度、邊緣情況；挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌株的顏色、形狀、有無(wú)芽孢情況[18]。

（2）生理生化鑒定

對(duì)篩選得到的乳酸菌進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)、產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)[19]。

（3）分子生物學(xué)鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取乳酸菌的基因組，以其為模板進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）；反向引物1541R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′）。PCR擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)[15]。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，30次循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)合格后送至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定后的結(jié)果登陸美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息（national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行Blast比對(duì)，采用Mega軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 碳源種類(lèi)對(duì)菌株Y-20產(chǎn)EPS的影響

用MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用等質(zhì)量的葡萄糖、D-果糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖替換，培養(yǎng)基滅菌后，按3%（V/V）接種量接種活化后的菌株Y-20，37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液中胞外多糖含量。探討培養(yǎng)基中不同碳源對(duì)菌株Y-20胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Y-20產(chǎn)EPS的影響

按3%接種量接種活化后的菌株Y-20至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)，每間隔4 h測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中的胞外多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

從自然發(fā)酵剁辣椒中篩選出一株疑似產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌Y-20，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.681 5x-0.027 7，R2=0.996 1）測(cè)得菌株Y-20所產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量為213 mg/L，通過(guò)與已報(bào)道文獻(xiàn)[2-3]的比較，菌株Y-20所產(chǎn)胞外多糖的含量較高。

2.2 菌株Y-20的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株Y-12的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 菌株Y-20在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain Y-20 on MRS agar medium

由圖1A可知，菌株Y-20的菌落呈圓形、凸起、微白色、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明，直徑為3 mm左右，菌落背面為黃色。由圖1B可知，菌株Y-20無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性、桿菌。因此，初步鑒定為一株乳酸菌。

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌株Y-20過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性、不能液化明膠、不產(chǎn)生硫化氫氣體、能在pH 4.5的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、能水解淀粉。菌株Y-20的碳源利用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株Y-20的碳源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Carbon source utilizing test results of strain Y-20

由表1可知，菌株Y-20能利用阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷、葡萄糖酸鈉；不能發(fā)酵纖維二糖、松三糖、菊粉、肌醇、七葉苷、扁桃苷。根據(jù)文獻(xiàn)鑒定標(biāo)準(zhǔn)[8]，初步鑒定菌株Y-20為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株Y-20的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株Y-20的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rDNA of strain Y-20

由圖2可知，PCR擴(kuò)增得到的基因片段大小在1 500 bp左右，與預(yù)測(cè)基因相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對(duì)，選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA序列菌株Y-20的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain Y-20 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株Y-20與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)的結(jié)果，鑒定菌株Y-20為一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 碳源種類(lèi)對(duì)菌株Y-20產(chǎn)胞外多糖的影響

碳源不僅可以為微生物的生長(zhǎng)提供重要的碳素來(lái)源和能量來(lái)源，而且不同的碳源對(duì)微生物EPS的產(chǎn)量影響很大[20]。5種碳源對(duì)菌株Y-20產(chǎn)EPS的影響如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)麥芽糖作為碳源時(shí)，菌株Y-12的胞外多糖產(chǎn)量最高，為221.38 mg/L，其次為葡萄糖，胞外多糖產(chǎn)量為217.12 mg/L，添加α-乳糖和D-果糖時(shí)，多糖的產(chǎn)量分別為214.04 mg/L和177.95 mg/L。

圖4 不同碳源對(duì)菌株Y-20胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the yield of extracellular polysaccharide by strain Y-20

2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Y-20產(chǎn)胞外多糖的影響

菌株Y-20的生長(zhǎng)曲線及不同時(shí)間對(duì)菌株Y-20產(chǎn)EPS的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 菌株Y-20的生長(zhǎng)曲線及胞外多糖產(chǎn)量Fig.5 Growth curve and extracellular polysaccharide yield of strain Y-20

由圖5可知，菌株Y-20的延滯期較短，培養(yǎng)3 h以后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，逐漸產(chǎn)生EPS，11 h以后開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期較長(zhǎng)（≥10 h），EPS含量逐漸增加并趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)16 h時(shí)菌體密度達(dá)到最大（3.62），EPS產(chǎn)量最高（242.95 mg/L）。

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵的剁辣椒中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株Y-20，經(jīng)形態(tài)觀察及生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，鑒定菌株Y-20為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。該菌產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源為麥芽糖，菌株Y-20生長(zhǎng)16 h時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值（OD600nm值3.62），胞外多糖產(chǎn)量最高，為242.95 mg/L。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用乳酸菌菌種資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。