白樺BpSPL2基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

王晟宇 張 淇 張正一 胡曉晴 田 晶 張 勇 劉雪梅

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，均具有含76個(gè)氨基酸的高度保守區(qū)段，以此同下游基因SQUAMOSA及其同源基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并調(diào)控表達(dá)，被命名為SBP結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)核定位信號(hào)[1]。SPL基因在參與發(fā)育階段轉(zhuǎn)變[2]、花和果實(shí)發(fā)育[3～4]、孢子發(fā)生[5～6]、植株形態(tài)建成[7]等方面起著重要作用。近年來，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)等模式植物中探索SPL功能已成為熱點(diǎn)。

開花是高等植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)，受外界環(huán)境(光照、溫度)和自身內(nèi)部因素的影響。擬南芥中至少存在4條開花誘導(dǎo)途徑,即光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑和自主途徑。SPL在植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心樞紐地位，能夠整合光周期和赤霉素(GA)兩條開花誘導(dǎo)途徑。研究表明擬南芥SPL基因通過直接激活花分生組織特異基因LEAFY(LFY)，F(xiàn)RUITFUL(FUL)和APETALA1(AP1)從而促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過渡，它們構(gòu)成一個(gè)內(nèi)源性開花途徑，可在短日照下不需經(jīng)由光周期途徑促進(jìn)開花[8～10]。AtSPL8影響花藥的發(fā)育而且參與調(diào)控GA的合成[5]，而AtSPL14作為負(fù)調(diào)控因子影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和開花的轉(zhuǎn)換過程[11]。擬南芥AtSPL3基因主要在花序中表達(dá),過量表達(dá)AtSPL3不僅會(huì)促進(jìn)開花,而且在長(zhǎng)日照和連續(xù)光照條件下還會(huì)導(dǎo)致花和花序發(fā)育異常。番茄LeSPL3在花序和花柄中大量表達(dá)，過量表達(dá)Le-SPL3基因會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)花柄離區(qū)離層細(xì)胞層數(shù)增加,花更易脫落,表明LeSPL3可能調(diào)控花柄離區(qū)的發(fā)育。在苜蓿(Medicagosativa)中，SPL13直接靶向R2R3-MYB基因影響側(cè)枝發(fā)育和開花時(shí)間[12]。此外，擬南芥SPL10的啟動(dòng)子在根中特異性表達(dá)，過表達(dá)該基因后，植物側(cè)根發(fā)育受到抑制[13]。Lannenpaa等從歐洲白樺(Betulapendula)中克隆鑒定了BpSPL1，其在花序、芽和葉中均有表達(dá)，可特異性結(jié)合BpMADS5啟動(dòng)子[14]。這些結(jié)果表明，SPL基因在植物中有多種表達(dá)模式，對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和花發(fā)育調(diào)控起重要作用。

啟動(dòng)子(promoter)是一段提供RNA聚合酶特異識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列，可控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)程度，通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)近端的核苷酸序列上游區(qū)域內(nèi)，主要由核心啟動(dòng)區(qū)、上游元件和應(yīng)答元件組成[15]。組織特異性啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物組織器官中定時(shí)、定點(diǎn)表達(dá)，這樣不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，增加區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)，如毛果楊(Populustrichocarpa)PTLF基因啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)GUS基因在楊樹葉脈、嫩枝頂端的擴(kuò)展葉和葉原基中表達(dá)[16]；GUS熒光定量檢測(cè)表明茶樹(Camelliasinensis)Cpcp啟動(dòng)子片段在花粉中表達(dá)，都說明其具有組織特異表達(dá)特性[17]。因此，近年來，組織特異性啟動(dòng)子逐漸成為研究重點(diǎn)。

白樺(Betulaplatyphylla)屬樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)，為喜光、適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、耐嚴(yán)寒和喜酸性土壤的落葉喬木[18]，雌雄同株異花，且花發(fā)育存在越冬宿存的現(xiàn)象[19]，是我國北方的主要用材樹種，也是天然次生林的先鋒樹種，在天然林更替方面起到了重要作用[20]。白樺花發(fā)育模式與草本植物相比存在明顯的差異，可能由其所特有的花發(fā)育基因調(diào)控路徑所致[21]。探索影響開花發(fā)育的SPL基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性將為揭示木本植物成花機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本文研究的BpSPL2基因(MF429834)與擬南芥AtSPL6/SPL13有較高的同源性，我們前期對(duì)BpSPL2基因轉(zhuǎn)化擬南芥后出現(xiàn)花敗育、側(cè)枝數(shù)量增多的表型(暫未發(fā)表)，暗示其可能參與花器官形態(tài)發(fā)育。本文通過PCR擴(kuò)增技術(shù)從白樺中得到BpSPL2啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行順式作用元件分析，構(gòu)建pBI121-pBpSPL2-GUS表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白樺和擬南芥，對(duì)GUS活性進(jìn)行特異性分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 白樺基因組總DNA的分離

以白樺組培幼苗為材料提取白樺基因組總DNA(DNA提取試劑盒購于天根公司)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)白樺基因組信息(http://birch.genomics.cn/page/species/index.jsp)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增白樺BpSPL2基因上游1 960 bp的基因序列，并由吉林省庫美生物科技有限公司合成。其中上游引物：BpSPL2-promoter1F序列為TGGAATAGAATCAAAGTCGC；下游引物：BpSPL2-promoter1R序列為CTCAAGTTTATCGGTCATGT。50 μL PCR反應(yīng)體系包括：2.5 μL白樺基因組DNA、5 μL 10×PCR Buffer(for KOD-Plus-Neo)、各1.25 μL上下游引物、3 μL 2.5 mmol·L-1MgSO4、31 μL無菌水、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs以及1 μL KOD-Plus-Neo(TOYOBO)。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min，變性98℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min后中止反應(yīng)。

1.3 目的片段克隆及測(cè)序分析

PCR產(chǎn)物利用1%(g/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，加A尾后使用試劑盒(天根公司)回收、純化目的片段，克隆目的片段于pMD18-T載體上(Invitrogen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選獲得陽性克隆，送由吉林省庫美生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 啟動(dòng)子序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析軟件，對(duì)克隆得到的BpSPL2基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行元件分析。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)BpSPL2基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)酶切引物，F(xiàn):GCGGATCCGGAATAGAATCAAAGTCGC(下劃線標(biāo)記為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，R:GCAAGCTTCTCAAGTTTATCGGTCATGT(下劃線標(biāo)記為HindⅢ酶切位點(diǎn))。從1.3中獲得的陽性克隆菌株中提取質(zhì)粒，用酶切引物進(jìn)行PCR膠回收后，同時(shí)將啟動(dòng)子和植物表達(dá)載體pBI121-GUS進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收純化的目的片段通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選和菌落PCR檢測(cè)獲得陽性克隆，提取陽性重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定，獲得重組植物表達(dá)載體，命名為pBI121-BpSPL2 promoter::GUS。

1.6 菌液的制備及轉(zhuǎn)化

通過凍融法將pBI121-BpSPL2 promoter::GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中。挑取農(nóng)桿菌單菌落在5 mL的LB液體培養(yǎng)基中28℃過夜培養(yǎng)，次日上午將該菌液用新鮮LB稀釋至OD值0.1左右，然后再進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液至OD600為0.6～0.7時(shí)，3 000 r·min-1離心10 min收集菌體，用于擬南芥和白樺的瞬時(shí)侵染。擬南芥轉(zhuǎn)化方法參照郭勇等[22]，白樺轉(zhuǎn)化方法參見李萌等[23]。每個(gè)試驗(yàn)取10個(gè)植株，重復(fù)3次。

1.7 GUS染色

X-GLUC染色液配制(100 mL)：200 mmol·L-1的pH=7.0的磷酸緩沖液50 mL；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-Gluc 60 mg，然后加水定容至100 mL。

將侵染處理后的擬南芥和白樺幼苗分別放入50 mL離心管中，各加入GUS染色液浸沒植株，37℃恒溫黑暗中過夜染色，再用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1脫色液脫色約1 h，其間適時(shí)更換脫色液，然后取出，觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpSPL2基因上游序列的獲得

通過PCR得到大小約為2 000 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相近。電泳分離回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR能得到長(zhǎng)度一樣大小的DNA片段，經(jīng)過測(cè)序?qū)Ρ群?，與在白樺基因組中查找的序列一致，說明該基因片段已經(jīng)克隆入pMD18-T載體。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜 M.DL-5000 Marker；1.PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoretogram of PCR product M. DL-5000 Marker; 1. PCR product

2.2 白樺BpSPL2基因啟動(dòng)子序列分析

利用PLACE和PlantCARE在線軟件對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列中除了含有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box、CAAT-box，同時(shí)還含有其它多種作用元件。其中包括3種脫水響應(yīng)元件(MYCATRD22、MYCCONSENSUSAT、ACGTATERD1)，3種傷害響應(yīng)元件(DOFCOREZM、WBOXNTERF3、WBOXATNPR1)，2種激素響應(yīng)元件(ARR1AT、WRKY71OS)，2種光調(diào)控相關(guān)元件(IBOXCORE、GATA-box)，1種低溫響應(yīng)元件(MYCCONSENSUSAT)等。

值得注意的是，該啟動(dòng)子同時(shí)含有2種與花粉特異性表達(dá)有關(guān)的順式作用元件POLLEN1LELAT52(AGAAA)和GTGANTG10(GTGA)，其中AGAAA序列有4個(gè)，GTGA序列有4個(gè)。由此可以推測(cè)，該基因啟動(dòng)子在某個(gè)時(shí)期可能驅(qū)動(dòng)基因參與白樺的開花調(diào)節(jié)，非生物脅迫響應(yīng)，激素響應(yīng)及光響應(yīng)等生物學(xué)過程中。具體的作用元件名稱、元件序列、個(gè)數(shù)及其生物學(xué)功能如表1所示。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將BpSPL2啟動(dòng)子和pBI121載體質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收純化目的片段，通過T4DNA連接酶連接。新的重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后得到2 000 bp左右的單一條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序比對(duì)后驗(yàn)證連接正確，植物表達(dá)載體pBI121-BpSPL2 promoter::GUS構(gòu)建成功(圖3)。

圖2 白樺BpSPL2基因啟動(dòng)子序列Fig.2 Promoter sequence of BpSPL2 gene for B.platyphylla

元件名稱Element names基序序列Motif sequences個(gè)數(shù)Numbers生物學(xué)功能FunctionTATA-boxTATA15核心啟動(dòng)元件Core actuating elementCAAT-boxCAAT13啟動(dòng)子增強(qiáng)區(qū)保守元件Conservative element of promoter enhance regionPOLLEN1LELAT52AGAAA4花粉特異表達(dá)的順式作用元件Cis-acting element for pollen specific expressionGTGANTG10GTGA4花粉特異表達(dá)的順式作用元件Cis-acting element for pollen specific expressionCURECORECRGTAC2銅離子響應(yīng)元件Copper ion responsive elementIBOXCOREGATAA1光調(diào)控相關(guān)元件Optical control related elementGATA-boxGATA5光調(diào)控相關(guān)元件Optical control related elementMYCATRD22CACATG1脫水及ABA響應(yīng)元件Dehydration and ABA response elementMYCCONSENSUSATCANNTG14脫水及寒冷響應(yīng)元件Dehydration and cold response elementTATABOX5TTATTT6啟動(dòng)子保守序列The promoter conservative sequencecircadianCAANNNNATC1生理周期調(diào)控元件Physiological cycle control elementARR1ATNGATT12細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件Cytokinin response elementWRKY71OSTGAC2赤霉素響應(yīng)元件Gibberellin response elementDOFCOREZMAAAG14傷害響應(yīng)元件Damage response elementWBOXNTERF3TGACY1傷害響應(yīng)元件Damage response elementWBOXATNPR1TTGAC1傷害響應(yīng)元件Damage response elementCCAAT-boxCCAAT2熱激信號(hào)響應(yīng)元件Heat shock signal response elementSkn-1-motifGTCAT1胚乳表達(dá)調(diào)節(jié)元件Endosperm expression regulatory elementACGTATERD1ACGT2與脫水有關(guān)的基因作用元件Gene action element related to dehydration

注:基序序列：Y=C/T，N=A/T/G/C

Note: Motif sequences:Y=C/T，N=A/T/G/C

圖3 農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè) M.DL-5000 Marker；1～10.陽性鑒定產(chǎn)物Fig.3 PCR result of positive Agrobacterium tumefaciens clone M.DL-5 000 Marker; 1-10.Positive identification product

圖4 白樺pBI121-BpSPL2 promoter::GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of pBI121-BpSPL2 promoter::GUS plant expression vector of B.platyphylla

2.4 白樺BpSPL2基因啟動(dòng)子在白樺中的表達(dá)活性

為了研究BpSPL2啟動(dòng)子的表達(dá)特征，我們將構(gòu)建好的pBI121-BpSPL2 promoter::GUS表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至白樺和擬南芥，然后進(jìn)行GUS染色分析。

以白樺組培苗為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，經(jīng)過BpSPL2-GUS侵染的白樺幼苗的根、莖、葉及芽經(jīng)GUS染色后均呈藍(lán)色(圖5A)，其中以幼葉、芽及根部的GUS染色較深，說明GUS基因在上述組織中的表達(dá)量較高，未轉(zhuǎn)化材料即陰性對(duì)照無任何GUS表達(dá)活性。

2.5 白樺BpSPL2基因啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)活性

對(duì)含有pBI121-BpSPL2 promoter::GUS報(bào)告載體的擬南芥植株進(jìn)行染色，觀察啟動(dòng)子啟動(dòng)活性及組織表達(dá)特異性。經(jīng)GUS染色后的對(duì)照組未顯藍(lán)色。經(jīng)含有目的啟動(dòng)子的表達(dá)載體工程菌液侵染后，植株的花、葉片、根部呈現(xiàn)藍(lán)色(圖6)，其中以花中的表達(dá)活性最為顯著。解剖GUS染色后的花器官發(fā)現(xiàn)，BpSPL2基因啟動(dòng)子在花瓣、花藥、雌蕊中強(qiáng)烈表達(dá)，在萼片中微量表達(dá)(圖7)。表明克隆獲得的白樺BpSPL2基因1 960 bp啟動(dòng)子區(qū)具有驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)活性的能力，在根、葉片和花中均具有表達(dá)活性。

3 討論

白樺(Betulaplatyphylla)為雌雄同株，單性花，

圖5 白樺GUS組織特異性染色植株 A. pBpSPL2::GUS農(nóng)桿菌侵染后白樺的GUS染色；B.未經(jīng)侵染的野生型白樺GUS染色Fig.5 Tissue-specific staining of GUS in B.platyphylla A. GUS staining of infected B.platyphylla; B. GUS staining of control group

圖6 擬南芥GUS組織特異性染色植株 A. pBpSPL2::GUS農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥GUS染色；B.未經(jīng)侵染的野生型擬南芥GUS染色Fig.6 Tissue-specific staining of GUS in A.thaliana A. GUS staining of infected A.thaliana; B. GUS staining of control group

圖7 擬南芥花器官GUS染色結(jié)果 A. pBpSPL2::GUS農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥花器官GUS染色；B.未經(jīng)侵染的野生型擬南芥花器官GUS染色Fig.7 GUS expression in floral organs of A.thalianaA. GUS expression in floral organs of infected A.thaliana; b. GUS expression in floral organs of control group

雄花發(fā)育非常特殊，發(fā)育周期長(zhǎng)達(dá)近一年，并以單核小孢子越冬，是一種研究單性花發(fā)育的理想試材。對(duì)白樺花發(fā)育的研究可以為今后進(jìn)行白樺花發(fā)育的分子調(diào)控、定向培育及遺傳改良提供理論依據(jù)，也可為具有較長(zhǎng)生殖周期的林木花發(fā)育機(jī)制提供參考信息。BpSPL2是白樺SPL基因家族的一員，SPL基因家族在植物花發(fā)育中起重要作用[6]。相較于其他擬南芥SPL基因，BpSPL2與AtSPL6、AtSPL13基因具有較高的同源性。AtSPL6在先天免疫中起重要作用，它能夠與核定位的免疫受體結(jié)合激活防御基因的轉(zhuǎn)錄[24]。過表達(dá)AtSPL13能部分恢復(fù)spl8花藥敗育的表型，原位雜交實(shí)驗(yàn)表明AtSPL13在花藥發(fā)育的第五階段的絨氈層細(xì)胞中表達(dá)[25]。

pBpSPL2-GUS在擬南芥花藥中具有較高的表達(dá)活性(圖7)，這暗示BpSPL2基因可能具有與AtSPL13相似的參與花藥發(fā)育的功能。同樣，與BpSPL2同源性較高的亮葉樺BlSPL11在雄花序發(fā)育的中間階段也具有較高的表達(dá)量[26]。

順式作用元件是同一DNA分子中具有特殊功能的轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)和其它調(diào)控基序，在基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控中起重要作用。BpSPL2基因啟動(dòng)子區(qū)域除了含有啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box、CAAT-box，同時(shí)還含有其它多種作用元件。其中包括激素響應(yīng)元件(ARR1AT、WRKY71OS)，光調(diào)控相關(guān)元件(IBOXCORE、GATA-box)，胚乳表達(dá)必須的順式調(diào)控skn-1元件及花粉特異表達(dá)相關(guān)的順式元件POLLEN1LELAT52和GTGANTG10元件。對(duì)生殖生長(zhǎng)階段各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)控作用的BpMADS12[27]和BpCUC2[28]基因啟動(dòng)子中存在多個(gè)POLLEN1LELAT52和GTGANTG10元件。另外，BpSPL2基因啟動(dòng)子還包含多個(gè)脫水及寒冷響應(yīng)元件、傷害響應(yīng)元件，與BpSPL2基因同源的苜蓿SPL13被報(bào)道參與干旱脅迫[29]，因此推測(cè)BpSPL2基因有可能參與非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

啟動(dòng)子順式作用元件分析為揭示白樺BpSPL2基因的功能提供了方向，而該基因的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步深入研究。