茶樹(shù)莖段組織培養(yǎng)過(guò)程中防褐化污染方法研究

吳婉婉，孫威江，陳志丹

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，350002；2.陜西果業(yè)集團(tuán)有限公司漢中獼猴桃研發(fā)中心，710000；3.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，350002；4.福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，350002；5.福建省茶產(chǎn)業(yè)行業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)基地，350002

植物組織培養(yǎng)自20 世紀(jì)初發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、林業(yè)等領(lǐng)域并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。污染、褐化和玻璃化[1-2]是植物組織培養(yǎng)中公認(rèn)的三大難題。茶樹(shù)是一類(lèi)多酚類(lèi)含量高且自身攜帶內(nèi)生菌較多的植物，在組培過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)外植體褐化、污染等問(wèn)題。游見(jiàn)明[3]、張婉婷等[4]對(duì)茶樹(shù)體內(nèi)內(nèi)生菌的動(dòng)態(tài)、分布規(guī)律等做了一些研究，但關(guān)于在茶樹(shù)組培過(guò)程中出現(xiàn)的內(nèi)生菌污染的防治還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)以福鼎大白茶嫩莖為材料，研究探討降低茶樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體褐化和內(nèi)生菌污染的幾種方法。

一、材料與方法

1.材料與主要試劑、設(shè)備

試驗(yàn)材料：春、秋季生長(zhǎng)帶飽滿腋芽的福鼎大白茶莖段。

主要試劑：95%無(wú)水乙醇、升汞（氯化汞）等。

儀器設(shè)備：電磁爐、自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋G154DS（致微廈門(mén)儀器有限責(zé)任公司）、純水器、超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）、接種器具消毒器（上海稼豐園藝用品有限公司）。

2.試驗(yàn)方法

（1）材料預(yù)處理

將所采集的用于腋芽誘導(dǎo)的材料剪去葉片和上、下端較嫩和較老的部分，留中間帶2～3 個(gè)腋芽的莖段，將材料置于燒杯中，先用洗衣粉水浸泡3～5 min，清洗掉表面塵土污垢（必要時(shí)用軟毛刷輕刷材料表面），倒掉洗衣粉水，在燒杯蒙紗布置于自來(lái)水下沖滴1.0～1.5 h，再用蒸餾水沖洗1遍，在燒杯外噴灑酒精后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)（超凈工作臺(tái)事先進(jìn)行紫外燈滅菌25 min左右），備用。

（2）外植體不同消毒方式比較試驗(yàn)

取經(jīng)預(yù)處理的福鼎大白茶莖段于燒杯中，在超凈工作臺(tái)上消毒，再用消毒后的手術(shù)刀將福鼎大白茶幼嫩莖外植體切成1 cm 左右?guī)? 個(gè)腋芽的莖段，接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種10個(gè)外植體，設(shè)3 次重復(fù)，14 d 后統(tǒng)計(jì)污染率和褐化率，記錄結(jié)果。

（3）不同種類(lèi)、濃度的吸附劑對(duì)福鼎大白茶外植體褐化的影響

通過(guò)在培養(yǎng)基中添加不同濃度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭（AC），比較其對(duì)福鼎大白茶外植體褐化的控制效果，以不加吸附劑的培養(yǎng)基（CK）為對(duì)照。PVP設(shè)置100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度，AC設(shè)置50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，接種14 d后統(tǒng)計(jì)褐化率。

（4）不同種類(lèi)、濃度的抗生素對(duì)福鼎大白茶外植體污染的控制效果

在培養(yǎng)基中分別添加抗生素氨芐青霉素（AMP）和硫酸鏈霉素（L），各設(shè)4個(gè)不同濃度處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，以不添加抗生素的培養(yǎng)基（CK）為對(duì)照，觀察接種后對(duì)外植體內(nèi)生菌的控制效果。

二、結(jié)果與分析

1.不同消毒方式對(duì)福鼎大白茶外植體污染率和褐化率的影響

不同消毒方式下福鼎大白茶外植體污染率和褐化率結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可見(jiàn)，B3 消毒方式能有效控制外植體的污染，但在控制褐化方面不及B1、B2；B1 處理在控制外植體褐化方面效果最好，但在控制污染方面不及B2、B3。綜合污染率、褐化率兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，較為理想的外植體消毒方式為B2：75%酒精20～25 s+0.1%升汞4 min+無(wú)菌水沖洗2遍+0.1%升汞5 min+無(wú)菌水沖洗4遍。

表1 不同消毒方式處理14 d后外植體污染率和褐化率結(jié)果

2.不同種類(lèi)、濃度的吸附劑對(duì)福鼎大白茶外植體褐化的影響

在培養(yǎng)基中添加不同種類(lèi)、濃度的吸附劑，觀察其對(duì)福鼎大白茶外植體褐化的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可看出，與對(duì)照相比，用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或活性炭（AC）處理后，外植體褐化率都低于對(duì)照（CK），說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加PVP或AC都能降低外植體的褐化率，但AC對(duì)外植體褐化的控制效果優(yōu)于PVP，最佳的AC質(zhì)量濃度為150 mg/L。

表2 不同濃度的PVP和AC處理對(duì)外植體褐化的控制效果

3.不同濃度的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)內(nèi)生菌的抑制效果

在培養(yǎng)基中分別添加氨芐青霉素和硫酸鏈霉素，以抑制外植體內(nèi)生菌，結(jié)果（表3）表明，8個(gè)處理與對(duì)照間都存在顯著性差異，說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)內(nèi)生菌都有一定的抑制效果，能夠顯著降低茶樹(shù)外植體的污染率，且硫酸鏈霉素的使用效果優(yōu)于氨芐青霉素，最佳的硫酸鏈霉素質(zhì)量濃度為150 mg/L。

表3 不同濃度的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對(duì)外植體污染率的影響

三、結(jié)論

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)。外植體滅菌要求做到既要少傷害外植體，又要盡可能地將組織材料表面的細(xì)菌、真菌等徹底殺死[5]。茶樹(shù)是木本植物，升汞是最佳的外植體消毒劑，但它對(duì)材料的毒害性要強(qiáng)于其他消毒劑，因此，在使用時(shí)要根據(jù)外植體的類(lèi)型、老嫩程度來(lái)選擇最佳的消毒時(shí)間和消毒方式。間歇性升汞消毒法對(duì)外植體進(jìn)行消毒時(shí)能夠較有效降低外植體的污染率，同時(shí)因在2 次升汞消毒之間加了無(wú)菌水清洗的過(guò)程，從而減輕了一次性升汞消毒對(duì)材料的毒害作用。

茶樹(shù)是多酚類(lèi)含量較高的植物，在進(jìn)行茶樹(shù)組培過(guò)程中，由于外植體要受到切割，產(chǎn)生傷口，其體內(nèi)原有的酶-底物的隔離被打破，一些酚類(lèi)、醌類(lèi)等有害物質(zhì)會(huì)順著傷口分泌到培養(yǎng)基中，積累到一定的量時(shí)，就會(huì)引起外植體發(fā)生褐化繼而死亡?；钚蕴烤哂卸嗫捉Y(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的吸附性，對(duì)分泌到培養(yǎng)基中的酚、醌等有一定的吸附作用，以減少它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的積累，從而達(dá)到防止褐化的目的[6]。

此外，茶樹(shù)體內(nèi)攜帶有較多內(nèi)生菌，組培過(guò)程中內(nèi)生菌也是引起外植體污染的主要原因之一，但由內(nèi)生菌引起的污染較難控制，一般的消毒劑對(duì)內(nèi)生菌來(lái)說(shuō)效果甚微。目前，研究人員對(duì)于組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的污染問(wèn)題，一般采用在培養(yǎng)基中加入殺菌劑[7]、抗生素[8-9]，或者在外植體類(lèi)型的選擇、滅菌方式等方面采取一些措施來(lái)克服此問(wèn)題。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，茶樹(shù)外植體采用75%酒精20～25 s +0.1%升汞4 min +無(wú)菌水沖洗2 遍+0.1%升汞5 min+無(wú)菌水沖洗4遍消毒后，接入含150 mg/L 活性炭和150 mg/L 硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能較好地控制茶樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體的褐化和污染問(wèn)題，提高茶樹(shù)組織培養(yǎng)成功率。