一種檢測(cè)Sn4+的羅丹明類(lèi)熒光探針的合成

解 璞，陳衛(wèi)星，王 婷，司樂(lè)樂(lè)，張?jiān)骑w

(西安工業(yè)大學(xué) 材料與化工學(xué)院，西安 710021)

錫是農(nóng)業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)中最常用的重金屬之一[1]。有機(jī)錫化合物會(huì)對(duì)生物體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害，并對(duì)胸腺和淋巴系統(tǒng)造成抑制。盡管無(wú)毒性，但濃度較高的無(wú)機(jī)錫可影響呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。因此，開(kāi)發(fā)可靠和敏感的分析方法來(lái)定性、定量評(píng)估環(huán)境和生物系統(tǒng)中存在的Sn4+非常重要。比色法和熒光法因具有操作簡(jiǎn)便,高選擇性及高靈敏度等特征成為監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)外金屬離子、陰離子和活性物質(zhì)等最有效的工具之一[2]。在各種熒光團(tuán)中，羅丹明類(lèi)化合物作為一種“明星”熒光分子，具有高熒光量子產(chǎn)率，光穩(wěn)定性，較長(zhǎng)的吸收和激發(fā)波長(zhǎng)等光物理、化學(xué)性能[3-6]。此類(lèi)熒光染料具有開(kāi)環(huán)和螺環(huán)的互變分子結(jié)構(gòu)，在該類(lèi)染料開(kāi)環(huán)狀態(tài)下500～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有特征吸收，散發(fā)出特別強(qiáng)烈的熒光，溶液呈粉紅色。目前，利用羅丹明類(lèi)熒光探針大致可以分為三類(lèi)：① 基于羅丹明衍生物螺酰胺環(huán)的“off-on”機(jī)理設(shè)計(jì)的熒光探針[7-9]；② 在羅丹明中位苯環(huán)上引入識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)的基于PET機(jī)理的熒光探針[10-12]；③ 改變3，6位氨基的供電子能力設(shè)計(jì)的反應(yīng)性熒光探針[13-14]。迄今為止，已經(jīng)制備出許多優(yōu)良的羅丹明染料來(lái)檢測(cè)各種金屬離子，如Al3+[15],Cu2+[16-17],Hg2+[18-19],Zn2+,Fe3+[17],Cr3+,Pb2+和Au3+[20]。但到目前為止，可用于錫離子檢測(cè)的羅丹明B類(lèi)探針相對(duì)較少。因此，合成能夠?qū)n4+檢測(cè)的高選擇性和靈敏度的羅丹明B類(lèi)探針是一項(xiàng)非常重要的工作。文中擬合成一種羅丹明類(lèi)熒光“開(kāi)-關(guān)”探針，并通過(guò)UV-Vis/FL光譜研究其對(duì)Sn4+的檢測(cè)性能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與表征

羅丹明B鹽酸鹽、三氯氧磷、2-氨基噻唑購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、三氯氧磷、2-氨基噻唑購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，所有實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用去離子水自制，光譜性質(zhì)測(cè)試使用水為二次蒸餾水。

熒光光譜使用Hitachi F-4500熒光分光光度計(jì)在1 cm石英池中進(jìn)行測(cè)試；UV-Vis光譜使用Shimadzu UV-1700光譜儀進(jìn)行測(cè)試；質(zhì)譜使用Brukermicro TOF-QⅡESI-Q-TOF LC/MS/MS飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)試；用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，在Varian INOVA-400MHz分光計(jì)(在1H NMR為400 MHz，13C NMR為100 MHz)下記錄NMR光譜。

1.2 儲(chǔ)備溶液制備

在乙腈中制備探針1儲(chǔ)備溶液(1 000 μmol·L-1)。在蒸餾水中制備各種金屬離子儲(chǔ)備溶液(1 000 μmol·L-1)。在滴定實(shí)驗(yàn)中，將不同量的Sn4+和0.10 mL的濃度為1 000 μmol·L-1的探針混合，并用磷酸緩沖鹽(Phosphate Buffer Saline,PBS)溶液定容至10 mL的容量瓶中進(jìn)行測(cè)試。在干擾實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將濃度c為30 μmol·L-1的Sn4+，0.10 mL的濃度為1 000 μmol·L-1的探針1和1.00 mL的濃度為1 000 μmol·L-1的干擾物質(zhì)混合，并用PBS溶液定容至10 mL容量瓶中進(jìn)行測(cè)試。

1.3 探針1的合成

將羅丹明B鹽酸鹽(4.78 g，0.01 mol)加入至1,2-二氯乙烷(10 mL)中，在溶液中加入5 mL三氯氧磷，攪拌并加熱回流6 h，蒸發(fā)濃縮。將得到的中間體溶于乙腈(10 mL)中，在30 min內(nèi)滴加含有2-氨基噻唑(1.00 g，0.01 mol)、三乙胺(5 mL)的乙腈(20 mL)溶液?；亓? h后，減壓蒸除溶劑，得紫色油狀液體。向混合液中加入水，用二氯甲烷萃取，并收集有機(jī)相。水洗，無(wú)水MgSO4干燥。提純采用柱層析分離，以甲醇∶二氯甲烷=1∶100作為洗脫劑，得粉紅色固體的探針1 (3.82 g)。核磁共振氫譜、核磁共振碳譜及飛行質(zhì)譜對(duì)探針?lè)肿拥慕Y(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)為:1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ8.03 (d,J= 7.1 Hz,1H),7.60～7.46 (m,2H),7.25 (s,1H),7.18 (d,J= 7.2 Hz,1H),6.80 (d,J= 3.5 Hz,1H),6.43 (d,J= 2.1 Hz,2H),6.39 (d,J= 8.8 Hz,2H),6.16 (d,J= 8.8,2.3 Hz,2H),3.30 (d,J= 9.6,7.2,2.8 Hz,8H),1.14 (t,J=7.0 Hz,12H)。13CNMR (100 MHz,DMSO)δ=153.8,148.7,138.6,134.1,128.5,127.9,124.7,123.3,112.5,107.3,106.5,97.55,67.53,44.27,12.64。MS (ESI) m/z = 525.383 3。[M+Na]+,calc.for C28H20N2O6Na+=525.231 9。探針?lè)肿拥暮铣删€(xiàn)路如圖1所示。

圖1探針的合成線(xiàn)路圖

Fig.1 Synthesis of probe

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對(duì)Sn4+的光學(xué)響應(yīng)

在溶劑為CH3CN-PBS (1/99,v/v,pH=7.4)的緩沖溶液中，熒光探針濃度為10 μmol·L-1，Sn4+濃度為30 μmol·L-1測(cè)試探針的熒光時(shí)間響應(yīng)和吸收響應(yīng)如圖2(a)和圖2(b)所示。圖2中熒光時(shí)間響應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)為510 nm，在576 nm處測(cè)試熒光強(qiáng)度，在559 nm處測(cè)試吸光度。探針的熒光信號(hào)和吸光度信號(hào)在5 min達(dá)到最大值。說(shuō)明該探針具有對(duì)Sn4+實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)。

2.2 探針對(duì)Sn4+的熒光滴定

在溶劑為CH3CN-PBS (1/99,v/v,pH=7.4)的緩沖溶液中，熒光探針濃度為10 μmol·L-1，Sn4+濃度為30 μmol·L-1測(cè)試探針?lè)肿优cSn4+的熒光滴定和紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖3所示，圖3(a)中插入TBT溶液中的熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)(λex=510 nm)，圖3(b)中插入吸收強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖2 探針?lè)肿拥臅r(shí)間響應(yīng)曲線(xiàn)

圖3 探針?lè)肿拥臒晒獾味ㄇ€(xiàn)

圖3中，由于內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，破壞了羅丹明的共振結(jié)構(gòu)，探針溶液幾乎沒(méi)有明顯的熒光。隨著Sn4+濃度的增加，探針熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)，在3.6倍 (離子濃度為36 μmol·L-1)時(shí)達(dá)到飽和。

在溶劑為CH3CN-PBS (1/99,v/v,pH=7.4)的緩沖溶液中，探針?lè)肿优cSn4+線(xiàn)性關(guān)系如圖4所示，熒光探針濃度為10 μmol·L-1，Sn4+濃度為30 μmol·L-1。

圖4中，熒光強(qiáng)度在576 nm處與Sn4+濃度(0.0～30 μmol·L-1)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。擬合出探針?lè)肿訉?duì)Sn4+的線(xiàn)性方程為y=159.8x+47.27(R2=0.995)，檢測(cè)限(S/N=3)為0.1 μmol·L-1。在紫外-可見(jiàn)吸收光譜中，擬合出探針?lè)肿訉?duì)Sn4+的線(xiàn)性回歸方程為y=0.010x-0.012 (R2=0.996)；吸收光譜中556 nm處的強(qiáng)吸收峰變化也與熒光強(qiáng)度增強(qiáng)一致。分析結(jié)果表明，探針?lè)肿涌捎糜赟n4+的定量檢測(cè)。

2.3 探針對(duì)離子的選擇性識(shí)別

高選擇性和高靈敏度是新型傳感器最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一。探針?lè)肿?10 μmol·L-1)在CH3CN-PBS(1/99,v/v,pH =7.4)溶液中Sn4+的離子干擾圖如圖5所示。

圖4 探針?lè)肿拥木€(xiàn)性關(guān)系

圖5 探針?lè)肿拥碾x子干擾

圖5中，前排支柱表示存在代表性金屬離子(100 μmol·L-1)的值。后排支柱表示隨后向含有探針?lè)肿?10 μmol·L-1)的溶液和相關(guān)離子(100 μmol·L-1)中加入Sn4+(30 μmol·L-1)的發(fā)射強(qiáng)度的變化。對(duì)于所有測(cè)試，在576 nm測(cè)試熒光強(qiáng)度，在559 nm處測(cè)試吸光度。為了確定探針?lè)肿訉?duì)金屬離子的識(shí)別性能，選擇了Li+,Na+,K+,Ba2+,Ca2+,Cd2+,Ag+,Mg2+,Co2+,Mn2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+,Ni2+,Cr3+,Cu2+,Fe2+,Fe3+,Sn4+作為識(shí)別對(duì)象。加入其他金屬離子時(shí)并不能引起熒光變化，只有加入30 μmol·L-1Sn4+在576 nm處熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)(559 nm處的吸光度)。為了進(jìn)一步分析其他金屬離子和Sn4+共存時(shí)對(duì)Sn4+測(cè)定的干擾，在30 μmol·L-1Sn4 +存在條件下，加入其他金屬離子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，Sn4+與競(jìng)爭(zhēng)離子的混合物誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度(吸光度)與Sn4+單獨(dú)引起的熒光強(qiáng)度(吸光度)相似，表明競(jìng)爭(zhēng)離子對(duì)Sn4+的檢測(cè)并沒(méi)有顯著影響。Sn4+的熒光吸收強(qiáng)度約為Cr3+熒光吸收強(qiáng)度的20倍；Sn4+的紫外吸光強(qiáng)度約為Cr3+紫外吸收強(qiáng)度的5倍，兩者相差較大。相較而言，Cr3+的影響不大。分析結(jié)果表明，探針?lè)肿訉?duì)Sn4+的檢測(cè)具有高選擇性和高靈敏度。

2.4 pH值對(duì)熒光光譜的影響

為了研究Sn4+檢測(cè)的合適pH范圍，文中研究探針?lè)肿右约疤结樂(lè)肿?Sn4+在不同pH下針對(duì)最大發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的影響。在λex= 510 nm 時(shí)，30 μmol·L-1Sn4+和10 μmol·L-1探針?lè)肿拥幕旌纤芤褐?，不同pH條件下的熒光強(qiáng)度如圖6所示。

圖6 不同pH條件下的熒光強(qiáng)度

圖6中，紅色曲線(xiàn)為探針?lè)肿?Sn4+在不同pH下對(duì)最大發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的影響，黑色曲線(xiàn)為探針?lè)肿釉诓煌琾H下對(duì)最大發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的影響。羅丹明化合物內(nèi)酰胺的存在形式會(huì)因溶液pH的不同而變化，進(jìn)而影響探針的熒光響應(yīng)。加入Sn4+后，在pH=6.8～8.0范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定且有異于探針本身的熒光強(qiáng)度。表明探針在pH=6.8～8.0范圍內(nèi)可以有效地檢測(cè)Sn4+，可應(yīng)用于細(xì)胞及生物體內(nèi)的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

1) 文中設(shè)計(jì)并合成了一種2-氨基噻唑修飾新型羅丹明熒光探針，通過(guò)核磁共振氫譜、核磁共振碳譜以及飛行質(zhì)譜對(duì)探針?lè)肿拥慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由于Sn4+引起螺環(huán)開(kāi)環(huán)，探針?lè)肿訉?duì)Sn4+顯示出高靈敏度和選擇性，隨著Sn4+濃度的遞增熒光強(qiáng)度整體呈遞增趨勢(shì)，并在一定范圍內(nèi)存在一定的線(xiàn)性關(guān)系；當(dāng)Sn4+達(dá)到一定用量時(shí)，遞增不再出現(xiàn)，最終趨于平衡；

2) 通過(guò)探針?lè)肿訉?duì)不同離子的檢測(cè)，可知探針?lè)肿幽軌驅(qū)n4+進(jìn)行專(zhuān)一、快速的識(shí)別，并不受其他金屬離子的干擾。通過(guò)pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)，表明探針?lè)肿涌蛇m用于微生物體系中Sn4+的定量檢測(cè)。