豬圓環(huán)病毒3型分子生物學檢測方法研究進展

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，直徑大小17～20 nm，是當前已知的能自主復(fù)制的最小哺乳動物病毒之一[1]。病毒對外界環(huán)境抵抗力強，在pH為3的環(huán)境中能存活較長時間，對熱具有一定的耐受力，豬群一旦感染后，很難徹底根除。PCV3不能凝集動物紅細胞。對氯仿、碘酒、酒精等具有一定耐受力，苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和氧化劑等均可殺滅病毒[2-3]。豬是PCV3的唯一宿主，各品種和日齡豬均可感染，妊娠母豬和哺乳仔豬受到的危害較為嚴重。母豬感染后可表現(xiàn)為厭食，皮膚出現(xiàn)變色、丘疹、皮炎等，妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙，產(chǎn)弱仔、死胎、木乃伊胎等，哺乳仔豬可變現(xiàn)為先天性震顫、多器官系統(tǒng)的功能紊亂等[4]。病豬和隱性感染豬是主要傳染源。病毒隨患病豬口、鼻腔分泌物及糞便排出體外，污染飼料、飲水及周邊環(huán)境，通過呼吸道和消化道感染其他健康豬只，也能通過公豬精液和穿過胎盤進行垂直傳播[5]。

2010年一些科研工作者報道在豬體內(nèi)檢測到一種新型的圓環(huán)病毒，2016年美國學者首次報道由這種病毒引起的豬病，并將其命名為PCV3，隨后巴西、韓國、泰國、波蘭、意大利、丹麥、德國和西班牙等國家均有相關(guān)報道，表明PCV3現(xiàn)已在全球養(yǎng)豬國家蔓延[6-9]。2017年，華南農(nóng)業(yè)大學宋長緒教授報道了中國首例PCV3，隨后追溯性研究表明PCV3于2015年即存在于中國豬場，此后呈現(xiàn)上升趨勢，目前PCV3在中國廣東省、山東省、河北省、遼寧省、江西省、重慶市、福建省、湖南省等地豬場均有存在[10-13]。

PCV3基因組為單股環(huán)狀DNA，大小約2 000 bp，GC含量為50%，基因組結(jié)構(gòu)與PCV1、PCV2相似，含有3個主要的開放閱讀框（ORF），ORF1、ORF2和ORF3[14]。其中ORF1編碼Rep蛋白，該蛋白與其他同屬的圓環(huán)病毒PCV1和PCV2 Rep蛋白氨基酸同源性高，ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，與PCV2 Cap蛋白氨基酸同源性僅為30%，推測二者之間交叉保護性低。ORF1和ORF2分別位于正鏈和負鏈上，且復(fù)制方向相反[15]。ORF3編碼蛋白功能尚不清楚。PCV3可接種單層豬腎細胞（PK-15）或豬睪丸細胞（ST）進行分離培養(yǎng)，但一般很難成功。本文就近年來PCV3核酸探針法、常規(guī)PCR法、套式PCR法、多種PCR、熒光PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)6種分子生物學檢測方法研究進展進行綜述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補的原理，用特異的基因探針即識別特異堿基序列（靶序列）的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術(shù)。Phan等利用靶向PCV3的探針進行原位雜交檢測豬肺臟中PCV3核酸含有情況，結(jié)果顯示，在呈現(xiàn)彌漫性肌漿/胞漿性反應(yīng)的多灶性心肌細胞、發(fā)炎小動脈中膜的平滑肌細胞和心肌中的炎癥細胞（大概是巨噬細胞）中較少檢測到PCV3 mRNA，在肺切片中未檢測到PCV3 mRNA[16]。

2 常規(guī)PCR法

PCR是以病原核酸為模板進行病原快速的方法，較病原分離鑒定等傳統(tǒng)的方法，檢測速度快，靈敏度高，在動物疾病診斷上得到了廣泛應(yīng)用。鄭慶禮等根據(jù)PCV3基因組序列，設(shè)計了1對引物，并對PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行優(yōu)化，同時進行特異性和敏感性試驗，結(jié)果顯示，建立的PCR方法的最佳反應(yīng)條件為總體積25μL，退火溫度56 ℃，模板DNA量3 μL（1ng·mL-1），進行35個循環(huán)[17]。該PCR能特異地擴增出目的片段，長度約為381 bp。測序結(jié)果表明，PCR擴增產(chǎn)物正確。該PCR反應(yīng)特異性強，只能擴增PCV3陽性樣品，且能擴增的最低模板量為1×10-4ng·mL-1。肖琦等根據(jù)Gen Bank登錄PCV3全基因組序列設(shè)了一對特異性引物，經(jīng)條件優(yōu)化，建立了檢測PCV3的PCR方法，擴增片段大小為932 bp，最低的質(zhì)粒檢測濃度為 10 copy·μL-1，對 PCV1、PCV2、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）的核酸進行擴增，均無PCV3目的條帶出現(xiàn)[18]。李曉菲等根據(jù)GenBank中PCV3核苷酸序列，設(shè)計上、下游引物，建立了一種快速檢測PCV3的PCR檢測方法，并對該方法的特異性、敏感性進行驗證，同時用該方法對臨床可疑樣品進行檢測，并對檢測結(jié)果進行測序驗證，結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性，與其他豬病病毒均無交叉反應(yīng)，同時該方法敏感性高，最低檢測限可達4.21×103copy·μL-1[19]。

3 套式PCR法

套式PCR，又稱巢式PCR。采用兩對引物擴增目的基因片段，第2對引物在第1對引物的內(nèi)部設(shè)計，以第1對引物的擴增產(chǎn)物為模板進行再次擴增，經(jīng)兩輪擴增，保證的擴增產(chǎn)物的特異性，提高了PCR檢測的敏感性。張志等根據(jù)PCV3全基因組序列，設(shè)計3條引物，建立了PCV3半巢式PCR診斷方法[20]。該法可以擴增出大小為249 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，而PCV1、PCV2、PRV、PPV等對照樣品均未擴增出特異性條帶。對PCV3的DNA檢測極限可以達到5×10-3μg·mL-1。對臨床80份樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR的陽性檢出率可以達到27.5%（22/80），而常規(guī)PCR的檢出率僅為6.25%（5/80）。

4 多重PCR法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，其是在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優(yōu)點而廣泛用于臨床的快速診斷。楊永寧等根據(jù)GenBank中PCV2、PCV3基因序列分別設(shè)計合成特異性檢測引物，建立了鑒別檢測PCV2和PCV3的雙重PCR方法[21]。該方法對PCV2、PCV3、PCV2/PCV3混合物可分別擴增出300、518、300和518 bp的特異性條帶，檢測PRV、PPV、PRRSV、CSFV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均為陰性，對PCV2/PCV3混合物的檢測靈敏度達2.1 ng DNA，與PCV2和PCV3單項PCR方法的符合率均為100%。季程遠等根據(jù)GenBank中PCV2和PCV3的全基因組序列，設(shè)計了兩對特異性引物，通過對擴增條件的優(yōu)化，建立了能夠同時檢測PCV2和PCV3的雙重PCR方法[22]。該方法可以同時擴增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特異性片段，而對PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV的核酸擴增結(jié)果均為陰性。對PCV2和PCV3的最低檢出量均為100 copy·μL-1。韓昊瑩等根據(jù)GenBank中登錄的PEDV和PCV3基因組序列，分別在M基因和Rep基因高度同源保守區(qū)設(shè)計兩對特異性引物，建立了檢測PEDV和PCV3雙重PCR方法，即可同時擴增225 bp（PEDV）和138 bp（PCV3）兩條特異性片段，而該方法對TGEV、豬博卡病毒、PCV2、大腸桿菌核酸擴增均為陰性，PEDV和PCV3的最低檢出量分別為428和325 copy·μL-1，且特異性強、敏感性好，為快速、高效檢測PEDV和PCV3提供了技術(shù)幫助[23]。宋德平等分別根據(jù)PRV gH基因、PCV2和PCV3 ORF2基因序列，設(shè)計3對引物，通過不斷優(yōu)化PCR條件，建立了同時檢測PRV、PCV2和PCV3三種病毒PCR檢測方法，擴增3種病毒的片段大小分別為356、248和408 bp[24]。特異性和敏感性結(jié)果顯示，方法特異性好，對豬德爾塔冠狀病毒（PD?CoV）、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的基因組擴增結(jié)果均為陰性，該方法對PRV、PCV3和PCV2的最低核酸檢測量均為1.0×103copy·μL-1，用法對采自江西省32個豬場256份樣品（肺、淋巴結(jié)、脾臟）進行檢測，結(jié)果顯示，PRV陽性樣品104份，PCV2陽性樣品有212份，PCV3陽性樣品2份。賀東生等根據(jù)GenBank公布的PVC3、非典型豬瘟?。ˋPPV）的保守基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計兩對特異性引物，建立了同時檢測PVC3和APPV的雙重PCR方法，通過優(yōu)化反應(yīng)條件PCV3、APPV引物的最佳使用量濃度均為20μM，50.1℃為最佳退火溫度，對PVC3和APPV病毒核酸分別擴增出535和869 bp特異性目的基因片段，方法特異性好，不能檢測出PRV、PPV、PRRSV、A型塞內(nèi)卡病毒（SVA）核酸，雙重PCR檢測方法對PCV3、APPV的最低檢出量分別為10.2×10-4、5.0×10-3ng·μL-1[25]。

5 熒光PCR方法

熒光PCR融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，檢測速度快、敏感高，可直接觀察擴增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了對環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結(jié)果。據(jù)信號基團的不同，實時熒光定量PCR可以分為染料法和探針法兩種。李卓昕等利用PCR方法擴增PCV3保守區(qū)基因片段（312 bp），將其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-PCV3作為陽性標準品質(zhì)粒[26]。優(yōu)化反應(yīng)條件，建立定量檢測PCV3的實時熒光定量PCR方法，并進行敏感性、特異性和重復(fù)性驗證。結(jié)果建立的SYBR GreenⅠRealtime PCR方法的Ct值與標準品模板在4.24×101～4.24×108copy·μL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.996，斜率為-4.384。該方法特異性強，與PRRSV、口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、PCV2及PRV均無交叉反應(yīng)，敏感性為4.24×101 copy·μL-1，比常規(guī)PCR方法高10倍，組間和組內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)均＜2%。郝占武等根據(jù)GenBank中公布的PCV3全基因組序列設(shè)計并合成1對引物，建立了基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測方法，以前期檢測的PCV3陽性樣品制備的質(zhì)粒DNA為模板，繪制了該real-time PCR的標準曲線和熔解曲線分析，并進行了敏感性、特異性和重復(fù)性試驗，結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，質(zhì)粒DNA稀釋至10-8后（濃度為5×102copy·μL-1）仍然可以檢出，可重復(fù)性試驗中各組的變異系數(shù)均＜3%[27]。李暢等根據(jù)PCV3 ORF2基因組保守序列設(shè)計合成4對引物，先使用熒光染料定量PCR法驗證其能否有效擴增目的片段，并根據(jù)結(jié)果和引物對所擴增序列的交集進一步設(shè)計TaqMan探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系建立快速檢測PCV3的實時熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果顯示，SYBR染料法和TaqMan探針法均能有效地擴增PCV3標準質(zhì)粒以及其他陽性樣品，并且對 1.29×102～1.29×109copy·μL-1的PCV3標準質(zhì)粒（pMD18-T-Cap）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該方法的檢測靈敏度為1.29×102copy·μL-1，比常規(guī)PCR的靈敏度高100倍，該方法與PCV2、豬輪狀病毒（RV）、PRRSV等病毒基因以及豬鏈球菌、豬肺炎支原體等細菌基因均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，批次內(nèi)重復(fù)和批次間重復(fù)試驗結(jié)果顯示變異系數(shù)（CV）均＜1.5%，呈良好的可重復(fù)性[28]。張志等根據(jù)PCV3全基因組為模板設(shè)計合成1對引物和1條TaqMan探針，建立了檢測PCV3的實時熒光定量PCR方法，經(jīng)過標準曲線分析、敏感性、特異性和重復(fù)性等一系列試驗，表明該方法具有特異性強、敏感性高以及重復(fù)性好的特點，試驗結(jié)果表明，陽性PCV3標準品DNA稀釋10-8后（濃度為50 copy·μL-1）仍然可以被檢出，不同濃度的組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果顯示變異系數(shù)均＜3%[29]。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法是日本學者Notomi等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。姜辰龍等根據(jù)其PCV3 ORF2基因保守序列，設(shè)計特異性引物，并通過Bst DNA聚合酶、引物最佳濃度比例、Mg2+、dNTPs和甜菜堿濃度及反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，59℃恒溫擴增36 min即可出現(xiàn)梯形條帶，且產(chǎn)物亦可通過SYBR GreenⅠ染色進行判斷[30]。該方法最低檢測限為 1.0×101copy·μL-1，與PRRSV、PRV、CSFV及PCV1和PCV2等均無交叉反應(yīng)。檢測68份呼吸道病豬淋巴結(jié)樣品，PCV3陽性率占30.9%，與PCR檢測結(jié)果符合率為95.6%（65/68）。李軍等根據(jù)其PCV3 ORF2基因序列，設(shè)計引物，不斷優(yōu)化條件，建立了PCV3 LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，整個反應(yīng)過程可在63℃恒溫條件下完成，檢測速度快，1 h內(nèi)可完成擴增反應(yīng)，結(jié)果判定簡便，依據(jù)反應(yīng)管濁度值的變化情況即可判斷，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果，不需開蓋，可避免氣溶膠污染[31]。從基因組DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2～3 h完成。用所建方法對PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、豬支原體的基因組擴增，方法靈敏度高，對PCV3 DNA最低檢測限約為 4.39×10-4ng·μL-1，是普通 PCR的 100倍。陳如敬等根據(jù)PCV3NS基因序列，設(shè)計特異性引物，建立一種檢測PCV3的LAMP擴增方法。該方法與豬其他常見病毒如PPV、PCV1、PCV2、PRV、PRRSV和CSFV不發(fā)生非特異性反應(yīng)，特異性強，準確度高，適用性好[32]。敏感性實驗表明，所建立的檢測方法能在62℃恒溫條件下60 min內(nèi)完成檢測反應(yīng)，最低可檢出76 ng·μL-1的PCV3核酸。反應(yīng)結(jié)束后，無需開蓋，直接根據(jù)顏色變化進行結(jié)果判定，這極大降低了污染的可能性，提高該方法的實用性。

7 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒病是國際公認的危害養(yǎng)豬業(yè)健康的主要疾病之一，PCV3是新發(fā)現(xiàn)的病毒，其引起豬病是一種新發(fā)的豬傳染病，引起了世界各國的高度重視和密切關(guān)注。當前對其研究還不夠深入，處于起步階段，對其致病機理等還不明確，鑒于PCV3相關(guān)疾病具有傳播途徑多、傳播速度快、流行范圍廣等特點?，F(xiàn)階段主要是開展PCV3流行病學調(diào)查，以掌握PCV3流行動態(tài)及對豬群危害，防止疫情的擴散與傳播。分子生物學檢測方法結(jié)合豬群臨床癥狀，可判定豬群現(xiàn)癥感染，盡早采取措施，降低損失。為提高檢出效率，可選取新鮮的病死豬肺、淋巴結(jié)、扁桃體、腦等組織樣本，活豬可選取血液、精液等進行檢測。

當前有多種PCV3分子生物學檢測方法，但各有利弊，常規(guī)PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能定量，且檢測敏感性不高。多重PCR方法，雖然可檢測多種疾病，但有時反應(yīng)條件很難兼顧，致檢測敏感性不高，容易漏檢，熒光PCR方法雖然克服了常規(guī)PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合基層應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

對PCV3相關(guān)疾病無有效藥物治療，也無有效疫苗。主要靠嚴格健全的生物安全措施進行防控，制定標準，并嚴格執(zhí)行，豬場做好清潔、消毒，防蚊滅蠅及滅鼠工作，規(guī)范引種，人員、物料和車輛做好消毒，減少豬群各種應(yīng)激，做到營養(yǎng)均衡，增強豬只抵抗力，病死豬及豬場糞污規(guī)范化處理。科研工作者應(yīng)加快疫苗研制開發(fā)研究。隨著技術(shù)的進步，未來一定會更好地防控該病，使豬場因該病造成的損失降低，保障我國生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。