黏膜免疫反應(yīng)與豬病預(yù)防用疫苗研究

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

大部分病原微生物都是通過(guò)黏膜途徑入侵動(dòng)物機(jī)體，引起感染和發(fā)病，健康動(dòng)物的黏膜可通過(guò)各種方式，發(fā)揮作用，抵御病原微生物的入侵，這些黏膜分布在與外界相通的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等表面[1-2]。黏膜及其周圍外分泌腺體的淋巴組織、全身血液和淋巴循環(huán)構(gòu)成機(jī)體的黏膜免疫系統(tǒng)，同細(xì)胞免疫和體液免疫一樣發(fā)揮黏膜免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體防病、抗病力[3-4]。黏膜免疫自出現(xiàn)以來(lái)，受到廣泛重視，與傳統(tǒng)體液和細(xì)胞免疫不同，黏膜免疫系統(tǒng)不僅局部產(chǎn)生具有分泌型的抗體，如分泌型的IgA（sIgA）、IgM（sIgM）和IgG等，在局部發(fā)揮作用阻斷病原入侵，還能促使全身黏膜免疫系統(tǒng)共同發(fā)揮作用，誘發(fā)全身免疫應(yīng)答[5-6]。通常黏膜局部抗體出現(xiàn)時(shí)間比血清抗體早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、效價(jià)高。

隨規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)注射免疫方式勞動(dòng)強(qiáng)度大，需大量人力、物力，易交叉污染，造成豬只應(yīng)激，急需采用新的免疫方式。黏膜免疫可通過(guò)氣霧、口服等途徑接種，對(duì)豬損害小，操作簡(jiǎn)單，并能通過(guò)占位效應(yīng)阻止病原在機(jī)體黏膜定植，發(fā)揮局部及全身免疫應(yīng)答作用。近年來(lái)，黏膜免疫受到廣泛關(guān)注，是未來(lái)豬病免疫的主要方向。要想達(dá)到理想免疫效果需根據(jù)不同病原的入侵途徑，有針對(duì)性地進(jìn)行研制相應(yīng)疫苗，并配合專屬黏膜免疫佐劑，使得通過(guò)黏膜途徑免疫的疫苗發(fā)揮最大作用，更好地保護(hù)豬只健康。現(xiàn)就豬各種疾病黏膜免疫疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為保護(hù)豬只健康提供思路。

1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）對(duì)哺乳仔豬的危害嚴(yán)重，尤其對(duì)7日齡仔豬，因腸上皮細(xì)胞更新速度慢，死亡率更高，通過(guò)母乳獲得的sIgA是仔豬抵抗病毒感染的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的母豬肌注滅活疫苗不能產(chǎn)生sIgA，而接種弱毒疫苗后可能會(huì)因弱毒含量低或在腸道中的增值能力低或與當(dāng)前流行毒株不匹配等問(wèn)題，不能產(chǎn)生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母豬乳腺產(chǎn)生sIgA，sIgA在腸道中穩(wěn)定性較好，可為仔豬提供被動(dòng)免疫保護(hù)。Hou等構(gòu)建了能表達(dá)PEDV N基因的重組乳酸桿菌，經(jīng)口服和滴鼻免疫小鼠后，通過(guò)測(cè)定血清中的抗體IgG的含量來(lái)判定免疫效果，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比無(wú)論是口服免疫還是滴鼻免疫組小鼠，免疫效果幾乎無(wú)差別，都能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)；在免疫后70 d采集小鼠腸液，并在84 d收集小鼠肺液，分別用間接ELISA方法檢測(cè)黏膜抗體IgA的含量，結(jié)果表明，腸液和肺液中均能檢測(cè)到高含量的抗體水平，且這些抗體具有中和PEDV的活性[7]。葛俊偉等構(gòu)建了表達(dá)PEDV COE基因的重組乳酸桿菌口服免疫小鼠，測(cè)定其免疫應(yīng)答水平，結(jié)果表明，免疫組小鼠血清、糞便中檢測(cè)到較高水平的特異性IgG、sIgA（P＜0.01），血清具有中和活性（1∶12），脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于對(duì)照組，IL-4和IFN-γ水平極顯著提高（P＜0.01）[8]。

2 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是經(jīng)腸道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入機(jī)體過(guò)程中具有重要作用。宋振輝等分別構(gòu)建了含TGEV M及N基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，將兩種重組病毒分別口服免疫小鼠，收集小鼠糞便檢測(cè)sIgA抗體水平，并檢測(cè)血清中IgG，結(jié)果顯示，這兩種不同的重組病毒分別免疫小鼠后，均可以誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生良好的體液和黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)[9]。劉義等將含有TGEV S基因的重組乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加強(qiáng)免疫共免疫3次，每次免疫連續(xù)灌服3 d，間隔兩周，免疫劑量為0.3～0.4 mL·只-1，第3次加強(qiáng)免疫后10 d，捕殺小鼠，采集血液、脾臟、糞便，處理后采用T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)及間接ELISA方法檢查免疫小鼠對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)答情況，結(jié)果表明，免疫組小鼠血清中的IgG、糞便中的sIgA與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）[10]。

3 豬輪狀病毒病

輪狀病毒可引起各種幼齡動(dòng)物腹瀉，也能導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)病，是一種人獸共患病原體。對(duì)輪狀病毒感染所引起的胃腸炎沒(méi)有特效治療藥物，只能通過(guò)疫苗免疫預(yù)防。目前，人用的輪狀病毒疫苗可口服免疫，效果較好，豬輪狀病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。葉麗萍等構(gòu)建了能表達(dá)輪狀病毒Vp4的重組乳酸菌，大量培養(yǎng)后離心，加入滅菌脫脂乳液給BALB/c小鼠灌服，檢測(cè)血清抗體和腸黏膜sIgA水平，并進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該重組菌能增強(qiáng)小鼠的黏膜免疫反應(yīng)，對(duì)豬輪狀病毒強(qiáng)毒株的攻擊具有一定的保護(hù)作用[11]。

4 豬偽狂犬病

由于偽狂犬病病毒并不引起毒血癥，而主要定植在三叉神經(jīng)，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效應(yīng)，從而抵抗野毒的感染。同時(shí)，黏膜免疫可以避免母源抗體對(duì)免疫產(chǎn)生的影響。用豬偽狂犬病病毒活疫苗在小豬1～3日齡噴鼻免疫，是豬場(chǎng)偽狂犬病凈化的第1步，能有效抵御偽狂犬病野毒的入侵。噴鼻免疫一定要操作正確，選用專用的噴鼻器，最好不要進(jìn)行滴鼻免疫，滴鼻時(shí)只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通過(guò)吞咽反射進(jìn)入胃內(nèi)被胃酸滅活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相應(yīng)的佐劑則能進(jìn)一步提高黏膜免疫的效果。豬場(chǎng)在噴鼻免疫的基礎(chǔ)上再做1～2次肌肉注射免疫以建立細(xì)胞免疫，防控偽狂犬病。

5 豬支原體病

豬支原體能與相應(yīng)的受體結(jié)合，并在黏膜部位的細(xì)胞內(nèi)增殖，通過(guò)“占位效應(yīng)”阻斷野毒的“入侵”。豬支原體活疫苗可噴鼻免疫，也可進(jìn)行噴霧免疫操作，當(dāng)噴霧免疫時(shí)一定要控制氣溶膠顆粒的大小，顆粒太大時(shí)，僅能到咽部，不能進(jìn)入氣管及肺部，太小時(shí)，即使吸入體內(nèi)也容易呼出，只有大小合適的顆粒才能在進(jìn)入肺部并停留。另外，噴霧時(shí)一定要保持抗原的活性，否則就失去意義。氣霧免疫能否取得良好的效果，取決于兩個(gè)關(guān)鍵因素，即如何保證噴霧顆粒的大小合理及微生物活性的保持。鄭鵬等用豬肺炎支原體活疫苗免疫健康家兔，并添加相應(yīng)佐劑以增強(qiáng)免疫效果，結(jié)果顯示，家兔免疫后均能產(chǎn)生良好的體液、細(xì)胞及黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，尤其以CPG佐劑組效果最好[12]。

6 豬圓環(huán)病毒病防控

圓環(huán)病毒2型（PCV2）可經(jīng)呼吸道、消化道、精液及胎盤等途徑傳播，能定植于黏膜系統(tǒng)（包括口鼻呼吸道、支氣管、肺及胃腸道黏膜）然后開(kāi)始復(fù)制，并突破血液屏障進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)。傳統(tǒng)的圓環(huán)病毒2型疫苗肌肉注射，只能獲得體液免疫，無(wú)法阻止PCV2在黏膜系統(tǒng)的定植復(fù)制及向體外排毒，黏膜免疫產(chǎn)生sIgA可通過(guò)黏膜免疫中和病毒，全面清除機(jī)體中的病毒。英國(guó)皇家科學(xué)院用食用酵母菌為載體研制了圓環(huán)的口服疫苗為粉末狀風(fēng)干重組酵母，可穩(wěn)定地表達(dá)PCV2b的殼蛋白，在母豬腸道建立了黏膜保護(hù)，從而顯著降低豬只體內(nèi)病毒含量，減少排毒，減輕臨床癥狀，使得糞便中IgA抗體和血清中IgG抗體水平顯著提高，從而降低了母豬圓環(huán)病毒2型的排毒感染壓力。

7 豬藍(lán)耳病防控

豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）可經(jīng)呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑感染豬，通過(guò)黏膜免疫可阻斷其感染。吳國(guó)軍等研究表明，通過(guò)鼻腔黏膜途徑接種PRRS疫苗弱毒CH-1R株能顯著刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生良好的體液和黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生良好的保護(hù)作用[13]。Han等構(gòu)建了表達(dá)PRRSV的ORF7基因重組減毒沙門氏菌，經(jīng)口服免疫小鼠12周后，在腸系膜淋巴結(jié)、小腸黏膜下淋巴集結(jié)、固有層淋巴細(xì)胞都檢測(cè)到sIgA[14]。王振華等構(gòu)建了表達(dá)PRRSV ORF6基因的重組乳酸桿菌，與黏膜佐劑CpG ODN聯(lián)合鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠，評(píng)價(jià)其佐劑效應(yīng)，結(jié)果表明，與單獨(dú)免疫佐劑和抗原組相比，免疫抗原配合CpG ODN佐劑組，血清中產(chǎn)生較高的IgG抗體水平，且呼吸道黏膜和腸道黏膜也能產(chǎn)生較高的sIgA水平抗體水平，其中呼吸道黏膜的sIgA水平抗體水平高于腸道黏膜。通過(guò)測(cè)定脾細(xì)胞懸液中細(xì)胞因子，比較各組細(xì)胞免疫效果，結(jié)果顯示，疫抗原配合CpG ODN佐劑組的IL-2、IFN-γ和IL-5活性均高于單獨(dú)免疫組（P＞0.05），與單獨(dú)佐劑組相比顯著升高（P＜0.01），但I(xiàn)L-4水平各組差異不顯著（P＞0.05）[15]。

8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）經(jīng)消化道、呼吸道進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，首先在咽喉部和扁桃體增殖，隨后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，因此黏膜免疫對(duì)預(yù)防口蹄疫具有重要意義。王瀟等分別構(gòu)建了含F(xiàn)MDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重組核表達(dá)質(zhì)粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，將兩種重組質(zhì)粒同時(shí)或pcD-VP1單獨(dú)免疫小鼠，檢測(cè)免疫效果，結(jié)果顯示，與單獨(dú)接種pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐劑后可誘導(dǎo)更高水平的黏膜sIgA的表達(dá)及分泌，極大地提高了黏膜部位抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)及CD4+T細(xì)胞中IL-4的表達(dá)量[16]。張馨玉等將經(jīng)殼聚糖包裹的口蹄疫核酸疫苗pcD-VP1制備成的納米顆粒，將納米顆粒和核酸疫苗同時(shí)分別經(jīng)4種不同黏膜途徑如口服、滴鼻、直腸和生殖道等免疫小鼠，檢測(cè)免疫效果，納米顆粒滴鼻和直腸免疫組，納米顆粒較單獨(dú)核酸疫苗組產(chǎn)生抗體的高峰提前2周，但口服和生殖道免疫組，納米顆粒較單獨(dú)核酸疫苗組產(chǎn)生抗體水平并沒(méi)有提高，但生殖道和直腸免疫組，納米顆粒較單獨(dú)核酸疫苗組產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[17]。

9 豬流感防控

豬流感病毒（SIV）主要經(jīng)呼吸道黏膜途徑感染豬，因此，局部黏膜免疫力的提升，可阻止SIV對(duì)豬的感染。師小瀟等選擇SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，將多個(gè)表位片段串聯(lián)，克隆到原核表達(dá)載體pET-30a（+）中，對(duì)串聯(lián)表達(dá)的重組SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，經(jīng)灌胃途徑免疫6周齡昆明小鼠，檢測(cè)免疫小鼠抗體及細(xì)胞免疫水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3免后各免疫組血清IgG抗體及黏膜sIgA抗體與對(duì)照組相比有著非常顯著的差異（P＜0.01），細(xì)胞免疫檢測(cè)顯示，所有免疫組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞增殖明顯，SIV血凝抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，SIV-ep1免疫組、SIV-ep2免疫組、SIVep1與LT蛋白免疫組抗SIV H1N1亞型HI效價(jià)達(dá)1∶1 024，SIV-el2蛋白免疫組HI效價(jià)達(dá)1∶512[18]。

10 小結(jié)

黏膜對(duì)主要經(jīng)黏膜途徑入侵豬的病原體有較好的防控作用，與常規(guī)免疫相比，經(jīng)黏膜途徑免疫操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，對(duì)豬應(yīng)激及副作用小，能發(fā)揮占位效應(yīng)，避免了潛伏期疾病的的人工接種感染，適合規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用。黏膜免疫不僅能形成局部免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)全身性細(xì)胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，是未來(lái)豬用疫苗很有前景的一種免疫方式。為提高黏膜免疫效果，還要進(jìn)行佐劑的篩選、免疫的途徑、抗原活性的最大保持及有效的利用等方面的研究。目前已有專家從豬體內(nèi)分離出腸道定植的益生菌作為疫苗的載體，制備成可口服的疫苗，能使疫苗的效力達(dá)到最佳。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，未來(lái)黏膜免疫一定會(huì)成為豬場(chǎng)的主流免疫方式。