阿月渾子雜種幼胚培養(yǎng)中褐化影響的研究

龐 曼 ，張 心 ，路 斌 ，馮獻賓 ，路丙社 ，王 超

（1.定州市綠谷農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河北 定州 073006；2.定州市科技技術(shù)局，河北 定州073006；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000）

阿月渾子（Pistacia vera L.）為漆樹科黃連木屬落葉小喬木，是世界著名干果和木本油料樹種，俗稱“開心果”，具有很高的經(jīng)濟價值，我國阿月渾子雖然已有上百年的栽培歷史，但根腐病、黃萎病和葉斑病危害嚴重，黃連木是我國特有的鄉(xiāng)土阿月渾子砧木資源和育種材料，對阿月渾子葉斑病有很強的抗性。通過雜交育種將阿月渾子早實豐產(chǎn)優(yōu)良特性與黃連木高抗病優(yōu)良性狀整合在一起，培育適宜中國氣候特點的抗病高產(chǎn)阿月渾子新品種前景廣闊[1-4]，但雜種胚敗育嚴重，幼胚培養(yǎng)是解決雜交胚敗育的有效途徑。因此，建立雜種胚搶救體系對實現(xiàn)阿月渾子的雜交育種有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。在植物組織培養(yǎng)中，外植體的褐化經(jīng)常發(fā)生，而褐化直接影響外植體的脫分化和再分化，甚至決定組培能否成功[5]。在建立阿月渾子幼胚離體培養(yǎng)體系時，褐化是導(dǎo)致培養(yǎng)材料死亡的主要原因之一。本試驗對阿月渾子幼胚培養(yǎng)褐化的原因及克服措施進行了研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河北省邯鄲市阿月渾子栽培示范園內(nèi)阿月渾子雜交果實，雜交父本為黃連木，雜交母本為引自美國的阿月渾子“Kerman”。

1.2 試驗方法

采集授粉后的雜種果實，于冰箱5 ℃冷藏后，去掉外果皮在流水下沖洗30 min，在超凈工作臺上用75%酒精浸泡2 min，20%次氯酸鈉滅菌10 min，無菌水沖洗3～4次，置于無菌濾紙上使種子表面的水分吸去，用已消毒的解剖刀和鑷子除去種皮或留存種皮，然后接種培養(yǎng)。每處理接種15瓶，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計褐化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實發(fā)育期對褐化的影響

由表1可以看出，80～120 d的果實褐化率和成活率存在顯著差異，但雜交果實的種胚隨著胚齡的增加，褐化率和成活率也顯著增加；授粉后80 d，100 d和120 d的雜種褐化率分別為30.66%，65.09%和75.63%，成活率分別為40.33%，61.67%和85.39%；從授粉后80 d至100 d褐化率增加了34.43%，成活率增加了21.34%。對果實解剖觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后80 d時種胚剛剛開始發(fā)育，但胚體很小，授粉后100 d時種胚已明顯發(fā)育，約占果腔的1/2；授粉后120 d時果實正常發(fā)育的種胚已充滿果腔，其果實發(fā)育越成熟，成活率越高，褐化程度也越高。

表1 胚齡對褐化的影響

2.2 種皮對褐化的影響

由表2可以看出，種皮的存在與否對于阿月渾子雜種胚的褐化率和成活率影響顯著。未去種皮處理接種的雜種胚褐化率和成活率分別為84.08%和15.84%，并且胚的子葉開始變褐或變黑，基本沒有再生小苗的可能性，而去種皮處理下，幼胚在接種20 d后褐化率和成活率為56.23%和92.49%，胚的萌發(fā)及生長良好，子葉開張，變綠，并且可獲得雜種小苗。種皮存在使褐化程度增加，抑制胚的萌發(fā)及成活，因此在進行雜種胚的胚培養(yǎng)或搶救時，去掉種皮培養(yǎng)有利于降低雜種胚的褐化，提高成活率。

表2 種皮對褐化的影響

2.3 不同培養(yǎng)溫度對褐化的影響

由表3可以看出，不同的培養(yǎng)溫度對雜交幼胚褐化的影響很大，隨著溫度的增加，幼胚的褐化率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在18 ℃溫度條件下，幼胚褐化率最低，即35.33%；而在26 ℃溫度條件下，幼胚褐化率為55.00%，雖然溫度只增加了8 ℃，褐化率卻增加了19.67%。說明低溫對褐化有一定抑制效果。

表3 培養(yǎng)溫度對褐化的影響

2.4 光照對雜種胚生長的影響

由表4可以看出，培養(yǎng)過程中光照的存在與否對于阿月渾子雜種胚的褐化有顯著影響，阿月渾子雜種胚在光照條件下褐化率為58.57%，而在黑暗條件下為36.23%。在黑暗條件下培養(yǎng)，胚培苗褐化較輕，生長的速度明顯加快，葉片較小且發(fā)黃。分析認為光照能夠促進阿月渾子組織培養(yǎng)中酚類物質(zhì)的氧化，加速組織褐變速度。因此，黑暗可以減輕褐化，有利于促進胚體所含營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和運輸，從而有利于幼苗健壯生長。

表4 光照對褐化的影響

3 結(jié)論與討論

褐化是離體組織細胞中多酚氧化酶活性增加，致使酚類物質(zhì)氧化生成棕褐色醌類物質(zhì)的結(jié)果[6-7]。阿月渾子遠緣雜種胚培養(yǎng)中褐化程度嚴重與否對成苗有著直接的影響。影響褐化的因素有很多方面，如合子胚的發(fā)育程度、雜交幼果的取樣時期、低溫冷藏處理時間、基本培養(yǎng)基的選擇以及激素的添加使用情況等。本研究以阿月渾子雜種幼胚為材料，著重研究探討了胚齡、種皮去留、培養(yǎng)溫度和有無光照培養(yǎng)條件對褐化的影響。

3.1 胚齡的影響

由于植物種類、發(fā)育時間不同，幼胚離體培養(yǎng)的成功率也不同。胚的發(fā)育程度即胚齡，是幼胚萌發(fā)成苗及培育健壯幼苗的前提和關(guān)鍵。一般胚的發(fā)育程度與褐化、成活率呈正相關(guān)，胚的發(fā)育程度越低，即胚的發(fā)育階段越早，褐化率和成活率越低；隨著胚的發(fā)育程度越高，成活率越高。因此，準確把握幼胚獲取時間至關(guān)重要[7]，阿月渾子雜種胚培養(yǎng)適宜的胚齡為授粉后100 d。

3.2 種皮去留的影響

本試驗中阿月渾子雜種幼胚種皮去留的試驗結(jié)果表明，去種皮接種褐化率明顯好于未去種皮的處理，可見種皮是抑制褐化的主要因素之一。因此，阿月渾子雜種胚培養(yǎng)時應(yīng)采取去種皮方式接種培養(yǎng)。

3.3 溫度和光照的影響

一定程度的高溫和光照強度能激活PPO活性，促進酚類物質(zhì)的氧化，加速組織培養(yǎng)的褐化[5，8]。本試驗對阿月渾子授粉后120 d幼胚進行了不同溫度和光照強度的培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在18 ℃低溫條件下和暗培養(yǎng)情況下可明顯減輕褐化的發(fā)生。