王玉全,李程程,蘇路路,管博文,盧延華,孟愛民,樊飛躍
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)
FOXO3A又名橫紋肌肉瘤樣1叉頭框(forkhead rhabdomyosarcoma-like1,FKHRL1),屬于叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)家族的O亞型,廣泛參與細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié), DNA損傷應(yīng)答以及抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)過程[1-4]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A在造血干細(xì)胞功能維持,造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用[4-7]。為了直接評價FOXO3A在造血系統(tǒng)損傷調(diào)節(jié)中的作用,探索相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制,為相關(guān)疾病的治療提供思路和方向,我們將FOXO3A基因敲除純合型小鼠在SPF級動物屏障環(huán)境飼養(yǎng)繁殖,成功繁育鑒定出FOXO3A基因敲除純合型小鼠。同時,通過流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)對野生型小鼠和純合型小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行檢測分析,為以后開展造血系統(tǒng)損傷研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
FOXO3A基因敲除小鼠(FOXO3A+/-)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所張連峰課題組儲存(store number:016132-UCD),雌性FVB/N小鼠4只,SPF級,體重16~18 g,5周齡;野生型雄性FVB/N小鼠2只,SPF級,體重16~18 g,5周齡,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[SCXK (京) 2016-0011]。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK (京) 2015-0035],按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng),飼養(yǎng)過程實(shí)行自由采食和飲水,墊料每周更換1次并補(bǔ)充飼料和飲用水。繁殖采用一雄一雌或一雄兩雌同籠合養(yǎng)方式進(jìn)行,雌鼠孕期為19~21 d,哺乳期為20~23 d,幼鼠在14日齡剪趾標(biāo)號,剪尾鑒定基因型,在21~24日齡分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)審批,IACUC號為:MAM17002。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)繁育和實(shí)驗(yàn)過程中,在不影響實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。
EasyPure Genomic DNA Kit購自Trans Gen Biotech公司,引物由上海賽默飛世爾科技公司合成,2×GC buffer、Recombinant Taq DNA Polymerase Taq購自TaKaRa公司,GelRedTM購自Bitotium公司,流式抗體CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均購自BD或 Bioscience公司;Bio-Rad T100 Thermal Cycler,Tanon-1600數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng),BD FACSAria TMⅡ流式細(xì)胞儀。
1.3.1 小鼠基因型鑒定
(1)小鼠基因組DNA的提取:小鼠剪趾標(biāo)號,剪尾0.5 cm置入1.5 mL無菌EP管中,參照Transgen的Genomic DNA Kit說明書提取基因組。
(2)引物設(shè)計(jì):如表1。
(3)PCR反應(yīng):根據(jù)Recombinant Taq DNA Polymerase Taq說明采用20 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增,其中2× GC buffer 10 μL、dNTP(2.5 mmol/L each)1.6 μL、Forward Primer(50 μmol/L)0.2 μL、Reverse Primer(50 μmol/L)0.2 μL、rTaq polymerase 0.2 μL、DNA template 3 μL、H2O 4.8 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性,3 min;94℃變性,30 s;58℃退火,30 s;72℃延伸,30 s;72℃后延伸,10 min;35個循環(huán)。
(4)瓊脂糖凝膠電泳鑒定:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL在含GelRed (1×)的2%瓊脂糖凝膠中以120 V電壓電泳20 min后于凝膠成像儀中觀察。小鼠組織基因組瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為野生型(FOXO3A+/+,WT):100 bp;純合型(FOXO3A-/-):186 bp;雜合型(FOXO3A+/-):100 bp、186 bp,基于此基因條帶可以鑒別每只小鼠基因型。
1.3.2 骨髓細(xì)胞檢測分析
為探討FOXO3A對造血系統(tǒng)的影響,進(jìn)行骨髓造血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分型檢測初步實(shí)驗(yàn)。
(1)骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù):取FOXO3A基因敲除純合型小鼠3只,雄性,體重25~31 g,11~16周齡;野生型3只作為對照,雄性,體重19~29 g,11~16周齡。小鼠脫頸處死,75%酒精浸泡消毒,無菌條件取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨,用1 mL PBS緩沖液沖洗骨髓至2 mL EP管中,采用KOVA一次性計(jì)數(shù)板,人工骨髓計(jì)數(shù)。
(2)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例測定[8]:分離的骨髓細(xì)胞,每只小鼠取5×106個細(xì)胞,終體積100 μL。按體積比1:20加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體(CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b),4℃孵育30 min,PBS洗滌一次,1500 r/min離心5 min,離心后去上清,100 μL PBS重懸,加入混合二抗抗體streptavidin(percp標(biāo)記)、scal-1(PE標(biāo)記)、ckit(APC標(biāo)記),4℃孵育30 min,PBS洗滌一次,離心條件如上,200 μL PBS重懸。 BD流式細(xì)胞儀檢測HPCs(Lin-c-kit+Sca1-or LSK- cells),HSCs(Lin-c-kit+Sca1+or LSK+cells)在骨髓中所占的比例。
FOXO3A基因敲除雜合型雌鼠成功繁殖出子代幼鼠,雌鼠妊娠期為19~21 d,哺乳期為20~23 d,每胎產(chǎn)6~13只幼鼠,成活率在98%以上。
隨機(jī)選擇出生15 d 1~9號小鼠剪趾標(biāo)號,剪尾提取基因組,分別用引物FOXO3A-A、FOXO3A-B和引物FOXO3A-A、FOXO3A-C進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用水作為空白對照,野生型小鼠基因組作為陰性對照,雜合型小鼠基因組作陽性對照。擴(kuò)增結(jié)果顯示陰性對照只擴(kuò)增得到100 bp條帶,為野生型小鼠;陽性對照擴(kuò)增得到100 bp和186 bp條帶,為雜合型小鼠;5、6號只擴(kuò)增得到186 bp條帶,為FOXO3A基因敲除純合型小鼠;2、3、8、9號為FOXO3A基因敲除雜合型小鼠,1、4、7號為野生型小鼠。(如圖1)
幼鼠由雌鼠哺乳喂養(yǎng),哺乳期為21 d左右,產(chǎn)后21~24 d離乳分籠。子代基因敲除純合型小鼠與雜合型小鼠長勢正常,與野生型FVB/N小鼠相比外觀、生長發(fā)育未見明顯差異。
小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,F(xiàn)OXO3A基因敲除純合型小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)與野生型小鼠相比[(6.167±1.424) vs. (10±1.732)],未見明顯差異(P=0.1625)。結(jié)果表明,F(xiàn)OXO3A基因敲除不會引起小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)目的明顯改變。(如圖2)
表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Protocol primers
圖3 FOXO3A基因敲除小鼠造血細(xì)胞表型分析Figure 3 Analysis of the phenotype of hematopoietic cells in FOXO3A knockout mice
注:A:1~9號小鼠用引物FOXO3A-A、FOXO3A-B擴(kuò)增結(jié)果;B:1~9號小鼠用引物FOXO3A-A、FOXO3A-C擴(kuò)增結(jié)果。M:DNA marker,2000 bp分子量標(biāo)準(zhǔn);N:陰性對照;P:陽性對照。圖1 子代小鼠基因型鑒定結(jié)果Note. A: Mice 1-9 were amplified with the primers FOXO3A-A and FOXO3A-B. B: Mice 1-9 were amplified with the primers FOXO3A-A and FOXO3A-C. M: DNA marker, 2000 bp; N: Negative control; P: Positive control.Figure 1 Genotype identification of daughter mice
圖2 FOXO3A基因敲除小鼠骨髓計(jì)數(shù)Figure 2 FOXO3A gene knockout mouse bone marrow cell counts
為了直接觀察FOXO3A基因敲除對小鼠造血系統(tǒng)的影響,我們采用流式細(xì)胞儀檢測FOXO3A基因敲除純合型小鼠和野生型小鼠的骨髓細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析時門的設(shè)置如圖3所示。我們檢測了造血祖細(xì)胞(lin-scal-1-ckit+,HPC),造血干細(xì)胞(lin-scal-1+ckit+,HSC)的比例和數(shù)目。結(jié)果如圖3所示,與野生型小鼠相比,F(xiàn)OXO3A基因敲除會引起骨髓中造血祖細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞數(shù)目卻沒有明顯改變(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)OXO3A基因敲除未發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的明顯差異。
FOXO3A作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子,有“長壽基因”之稱,廣泛表達(dá)于成人各種組織器官中。目前研究認(rèn)為FOXO3A參與多種疾病致病調(diào)節(jié)過程,例如腫瘤[9]、血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病[10]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11]等。先前研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A可以通過調(diào)控氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的功能[12, 13],F(xiàn)OXO3A基因缺陷小鼠隨年齡增長或給予5-氟尿嘧啶(5-FU)刺激表現(xiàn)中性粒細(xì)胞增多,造血干細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)激活及增殖抑制蛋白Spred2(Sprouty-related Ena/VASP homology 1 domain-containing proteins 2)、p27Kip1表達(dá)下調(diào),表明FOXO3A在造血干細(xì)胞功能維持及抗應(yīng)激調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。近來研究發(fā)現(xiàn)由Fancd2基因介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路與FOXO3A基因介導(dǎo)的應(yīng)激調(diào)節(jié)通路在造血干細(xì)胞維持上存在功能性互作[5],這為應(yīng)激誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞衰竭等血液疾病治療開辟新的靶點(diǎn)。同時,衰老的造血干細(xì)胞中存在完整的FOXO3A介導(dǎo)的促自噬信號通路,保護(hù)其免受骨髓微環(huán)境中出現(xiàn)的能量危機(jī)、細(xì)胞因子匱乏等代謝應(yīng)激損傷[14]。衰老的造血干細(xì)胞易于積累DNA損傷,通常功能喪失,被認(rèn)為是提高老年人血液系統(tǒng)疾病發(fā)生率的根本原因之一[15]。由此,F(xiàn)OXO3A調(diào)節(jié)的促自噬機(jī)制是否通過保護(hù)損傷、功能缺陷的衰老造血干細(xì)胞而直接導(dǎo)致衰老相關(guān)血液系統(tǒng)疾病的發(fā)展也是我們值得關(guān)注的。
FOXO3A基因敲除動物模型對直接評價FOXO3A功能、活性調(diào)控機(jī)制,了解FOXO3A在不同情況下的調(diào)節(jié)機(jī)制,為血液病等疾病的治療提供新思路是十分重要的。FVB/N品系小鼠受精卵有大而顯著的前核,易于進(jìn)行顯微注射,易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因模型構(gòu)建,同時,F(xiàn)VB/N小鼠繁殖力較強(qiáng),子代數(shù)目多,采用FVB/N品系小鼠構(gòu)建基因缺陷動物模型能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利開展提供模型保障。
將FVB背景的FOXO3A基因敲除雜合型小鼠嚴(yán)格按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)和繁育。雜合型小鼠與野生型交配,子代經(jīng)基因型鑒定后選育出雜合子,采用雜合子雌雄配對繁殖保種,可獲得FOXO3A基因敲除純合型小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。FOXO3A基因敲除雜合型雌鼠成功繁殖出子代幼鼠,雌鼠妊娠期為19~21 d,哺乳期為20~23 d,每胎產(chǎn)6~13只幼鼠,成活率在98%以上。幼鼠由雌鼠哺乳喂養(yǎng),哺乳期為21 d左右,產(chǎn)后21~24 d離乳分籠。子代基因敲除純合型小鼠與雜合型小鼠長勢正常,與野生型FVB/N小鼠相比外觀、生長發(fā)育未見明顯差異。飼養(yǎng)繁育過程中,雌鼠會出現(xiàn)長時間不孕或產(chǎn)子率低的情況,應(yīng)考慮互換雄鼠或替換掉年齡較大的雌鼠;若在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)噪音分貝高或驚嚇,會發(fā)生食子現(xiàn)象;偶爾也出現(xiàn)雌鼠懷孕或產(chǎn)仔后雄鼠死亡現(xiàn)象,建議平時多注意觀察照料。
基因型鑒定過程中,我們設(shè)計(jì)了三條引物,一條為通用引物,一條與通用引物來鑒定野生型,另外一條與通用引物來對鑒定FOXO3A基因敲除。通過兩對引物的擴(kuò)增情況來反映小鼠的基因型。同時,為了避免結(jié)果中出現(xiàn)的假陽性,增加鑒定的可靠性,我們設(shè)置水作為空白對照,野生型作陰性對照,雜合子或純合子作陽性對照。
為了評價FOXO3A基因敲除對小鼠造血系統(tǒng)的影響,我們分別對FOXO3A基因敲除小鼠和野生型對照小鼠進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)分析,并采用流式細(xì)胞儀分別檢測其造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的比例和數(shù)目。結(jié)果顯示,骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù),野生型小鼠和FOXO3A基因敲除小鼠相比,差異無顯著性。HSC比例和數(shù)目,兩組間沒有明顯的變化。FOXO3A基因敲除的HPC的比例較野生型有所增加,但是數(shù)目差異無顯著性。綜上,F(xiàn)OXO3A基因敲除對小鼠造血系統(tǒng)表型沒有明顯的影響,初步測定結(jié)果可用于造血干細(xì)胞研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。我們后續(xù)也會開展一系列實(shí)驗(yàn)來評價FOXO3A基因敲除對小鼠造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及功能的影響。
(致謝:感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所張連峰教授、關(guān)菲菲老師、高翔老師給予的指導(dǎo)幫助。)