溫經(jīng)止痛方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

黃艷輝，馮 丹，丑 丹，劉 佳，祁 慧，劉雯雯，王 靜

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院婦科，武漢 430010)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，是婦科領(lǐng)域中的多發(fā)病、疑難病，其進(jìn)行性加重的盆腔粘連、疼痛和不孕對(duì)女性生理和心理造成了極大的負(fù)擔(dān)，傳統(tǒng)藥物治療手段效果欠佳、不良反應(yīng)明顯，復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量，因此防治EMS一直是婦科領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

AKT/mTOR信號(hào)通路是被研究最多的細(xì)胞膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、以及促進(jìn)新血管生成方面發(fā)揮重要作用[1]。Li等[2]經(jīng)研究證實(shí)，激活的AKT通路可以上調(diào)增殖細(xì)胞核抗原、抗凋亡分子、生存素、粘附相關(guān)分子、整合素b1和整合素avb3的表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、粘附和侵襲。亦有研究發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜的浸潤(rùn)和種植，推動(dòng)EMS的發(fā)生和發(fā)展。[3-4]。

本課題組前期研究表明，溫經(jīng)止痛方治療EMS，取得較好臨床療，可明顯緩解患者痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛，改善生育能力，促進(jìn)妊娠等[5]。本研究以AKT/mTOR通路為切入點(diǎn)，深入探討溫經(jīng)止痛方治療EMS的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性成熟未交配過(guò)的Wistar大鼠120只，體重200～250 g，鼠齡8～12周，均購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK (鄂) 2015-0018]，無(wú)菌手術(shù)在武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK (鄂) 2016-0056]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：L20170001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用按照3R原則給予人道的關(guān)懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)藥物：溫經(jīng)止痛方：當(dāng)歸15 g、桂枝10 g、赤芍15 g、細(xì)辛3 g、炙甘草6 g、吳茱萸3 g、炮姜10 g、黃酒75 mL等組成，購(gòu)自武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥房(天濟(jì)中藥飲片公司)，于我院制劑室煎煮濃縮，具體步驟如下：中藥生藥按上面處方比例調(diào)配總計(jì)21.59 kg，分為兩鍋，加水10倍，煎煮2次，第一次30 min，第二次20 min，合并濾液，加入黃酒7瓶，濃縮至8.5 L，加入防腐劑放入冰箱備用；孕三烯酮(每粒2.5 mg，北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

TRIzol，Invitrogen公司提供(15596018)；ReverTra Ace? qPCR RT Kit及SYBR? Green Real-time PCR Master Mix，購(gòu)自Toyobo公司(561800，642800)；兔抗AKT、mTOR多克隆抗體濃縮液及Biotin-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(20657-1-AP，10176-2-AP，SA00004-2)；ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司(CSB-E08008r，CSB-E08005r)。

電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠(DYY-6C)；定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購(gòu)自ABI公司(7900HT)；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海析譜(UV-2202)；移液器購(gòu)自法國(guó)Gilson公司；脫水機(jī)、包埋機(jī)購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立內(nèi)異癥動(dòng)物模型

參考Jones手術(shù)移植改良方法建立模型[6]，120只雌性成熟Wistar大鼠，定時(shí)進(jìn)行陰道涂片檢查，選擇動(dòng)情期造模。手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，麻醉大鼠后，將大鼠固定于手術(shù)板上，腹部剪毛，皮膚消毒后，在尿道上端約2 cm處，沿腹部中線切開約3 cm的切口，找到左側(cè)子宮，分離附著于子宮肌壁的脂肪和結(jié)締組織后，在離卵巢約l cm處剪取長(zhǎng)2 cm子宮，斷端結(jié)扎。將所取子宮組織置于洛氏營(yíng)養(yǎng)液中，剪取約0.5 cm × 0.5 cm大小3塊內(nèi)膜，分別縫于子宮分叉處、右卵巢附近，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組采用相同大小的大網(wǎng)膜脂肪作移植物，其余處理措施同上。建模4周后，擇動(dòng)情期開腹，再次觀察移植物生長(zhǎng)情況。造模成功的標(biāo)志為：移植物體積增大，并形成內(nèi)有液體積聚、表面有血管攀生的透明小泡，同時(shí)取移植物送病檢證實(shí)內(nèi)膜成活，證明建模成功。

建模后每組選取2只觀察移植物生長(zhǎng)情況；在建模及飼養(yǎng)過(guò)程中每組都有大鼠死亡，共有22只大鼠死亡。最后中藥中劑量組存活最少(15只)，故每組取15只檢測(cè)指標(biāo)。

1.3.2 分組、給藥及處理

將建模成功的大鼠稱重后隨機(jī)分為5組，加正常對(duì)照組(假手術(shù)組)共6組，各15只。中藥高、中、低劑量組，分別給予7.4 g/mL、3.7 g/mL、1.85 g/mL的溫經(jīng)止痛方中藥，每日1 mL/100 g灌胃。西藥組：孕三烯酮膠囊0.05 mg/mL，每次1 mL/100 g灌胃，每周2次。模型組及正常組：每日生理鹽水1 mL/100 g灌胃。均給藥8周。

取材：各組大鼠分別于最后一次灌胃24 h后麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-20℃保存待測(cè)，再用兩腳規(guī)測(cè)量移植物的體積：長(zhǎng)(cm)×寬(cm)×高(cm)。取下在位子宮內(nèi)膜及子宮分叉處、右卵巢附近部位的移植病灶，-80℃冰箱凍存?zhèn)錂z。

1.3.3 HE染色

組織固定切片脫蠟后，常規(guī)染色光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)異位、在位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA的表達(dá)水平

熒光定量PCR采用TRIzol法提取RNA，將得到的RNA于BioTek ELx808酶標(biāo)儀上行純度及濃度的測(cè)定，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后于Roche定量?jī)x器上，按免疫熒光定量試劑盒(Toyobo公司)進(jìn)行定量，雙△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列均為5’→3’方向見表1。

1.3.5 免疫組化法檢測(cè)AKT、mTOR蛋白的表達(dá)

采用第二代免疫組化Elivision二步法檢測(cè)。一抗分別為兔抗AKT、mTOR多克隆抗體濃縮液，二抗為偶聯(lián)生物素的抗兔抗體(均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，AKT用已知的陽(yáng)性表達(dá)的胰臟切片做陽(yáng)性對(duì)照，mTOR用已知陽(yáng)性表達(dá)的肝組織切片做陽(yáng)性對(duì)照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 采用ELISA檢測(cè)大鼠血清各細(xì)胞因子

ELISA法檢測(cè)VEGF的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。所有標(biāo)本在一批內(nèi)測(cè)定，批內(nèi)誤差< 10%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 模型大鼠異位灶Figure 1 Ectopic focus of endometriosis in a model rat

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 EMS模型大鼠移植物的組織學(xué)形態(tài)

建模4周后，擇動(dòng)情期開腹，觀察子宮內(nèi)膜異位種植生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)腹膜表面的移植物生長(zhǎng)欠佳，卵巢表面及子宮分叉處移植物生長(zhǎng)非常良好，移植物體積增大，并形成內(nèi)有液體積聚、表面有血管攀生的透明小泡，見圖1。HE染色結(jié)果顯示，EMS模型大鼠的異位內(nèi)膜組織與正常子宮內(nèi)膜的組織學(xué)形態(tài)基本相似，異位內(nèi)膜組織的內(nèi)膜下層變薄，腺體減少甚至消失，肌層變薄并出現(xiàn)纖維化，沒有明顯的外膜，僅有一些纖維組織包裹。見圖2。

2.2 免疫組化檢測(cè)AKT、mTOR在各組在位、異位內(nèi)膜上表達(dá)情況

AKT主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中表達(dá)，mTOR主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，如圖3～4。EMS模型組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜上AKT、mTOR的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組在位內(nèi)膜(P< 0.01)，見表2～3。

注：A：在位內(nèi)膜；B：異位內(nèi)膜。圖2 EMS模型大鼠在位和異位內(nèi)膜的組織學(xué)形態(tài)(HE染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium; B: Ectopic endometria.Figure 2 Histological features of eutopic and ectopic endometria in EMS model rats. HE staining

注：A：正常組在位內(nèi)膜；B：西藥組在位內(nèi)膜；C：中藥高劑量組在位內(nèi)膜；D：模型組異位內(nèi)膜；E：西藥組異位內(nèi)膜；F：中藥高劑量組異位內(nèi)膜。圖3 大鼠在位及異位內(nèi)膜AKT的表達(dá)情況(免疫組化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 3 Comparison of AKT protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

注：A：正常組在位內(nèi)膜；B：西藥組在位內(nèi)膜；C：中藥高劑量組在位內(nèi)膜；D：模型組異位內(nèi)膜；E：西藥組異位內(nèi)膜；F：中藥高劑量組異位內(nèi)膜。圖4 大鼠在位及異位內(nèi)膜上mTOR的表達(dá)情況(免疫組化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 4 Comparison of mTOR protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

表2 免疫組化檢測(cè)六組EMS模型大鼠異位、在位內(nèi)膜上AKT的表達(dá)比較(n=15)Table 2 Comparison of AKT expression in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，**P< 0.01；與模型組異位內(nèi)膜比較，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

表3 免疫組化檢測(cè)六組EMS模型大鼠異位、在位內(nèi)膜上mTOR的表達(dá)比較(n=15)Table 3 Comparison of mTOR expression in in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，**P< 0.01；與模型組異位內(nèi)膜比較，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

溫經(jīng)止痛方中藥低、中、高劑量組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR表達(dá)水平逐漸減弱，中藥中、高劑量組在位內(nèi)膜及中藥高劑量組異位內(nèi)膜上AKT、mTOR明顯低于模型組(P< 0.05)。西藥組在位內(nèi)膜上AKT亦明顯低于模型組(P< 0.05)。見表2～3。提示EMS模型組大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR表達(dá)水平升高，溫經(jīng)止痛方中藥可使EMS模型大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平下降，中藥高劑量組效果最佳。

2.3 Real-time PCR法檢測(cè)AKT、mTOR mRNA在各組大鼠在位、異位內(nèi)膜上表達(dá)情況

分別提取在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的總RNA及蛋白，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)AKT、mTOR mRNA的表達(dá)。模型組在位、異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA表達(dá)含量高于正常對(duì)照組在位內(nèi)膜，差異有顯著性(P< 0.01)，詳見表4。

中藥高、中劑量組異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA含量明顯低于模型組異位內(nèi)膜(P< 0.05)，中藥中劑量組異位內(nèi)膜AKT、mTOR mRNA含量明顯低于西藥組異位內(nèi)膜(P< 0.05)。中藥高、中、低劑量組、西藥組在位內(nèi)膜AKT mRNA表達(dá)含量明顯低于模型組在位內(nèi)膜(P< 0.05)，其上mTOR mRNA表達(dá)含量亦低于模型組，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，詳見表4。

以上數(shù)據(jù)說(shuō)明EMS模型組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA表達(dá)含量升高，溫經(jīng)止痛方中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平下降。

2.4 溫經(jīng)止痛方對(duì)EMS模型大鼠血清中VEGF水平的影響

EMS模型組血清VEGF水平均高于正常對(duì)照組(P< 0.01)。溫陽(yáng)化瘀法中藥高、低劑量組、西藥組血清VEGF水平明顯低于模型組(P< 0.01)；中藥中劑量組亦低于模型組(P< 0.05)。中藥高劑量組血清VEGF水平低于中藥中、低劑量組，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，詳見表5。

以上結(jié)果提示EMS模型大鼠血清VEGF水平表達(dá)升高，溫陽(yáng)化瘀法中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并隨中藥濃度升高，其對(duì)VEGF分泌的抑制作用增強(qiáng)。

表4 RT-PCR法檢測(cè)AKT、mTOR mRNA的在各組內(nèi)膜上表達(dá)情況Table 4 Expression of AKT and mTOR mRNAs in the endometria of each group determined by RT-PCR

注：與模型組在位內(nèi)膜比較，*P< 0.05；與模型組異位內(nèi)膜比較，#P< 0.05；與西藥組異位內(nèi)膜比較，▲P< 0.05。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,*P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the model group,#P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the Nemestran group,▲P< 0.05.

表5 六組EMS模型大鼠血清VEGF水平的比較Table 5 Comparison of serum VEGF levels in the six groups of EMS model rats

注：與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

隨著研究日漸深入，證實(shí)AKT/mTOR信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在EMS中存在該信號(hào)通路的過(guò)度激活，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、凋亡因子等的表達(dá)，影響異位內(nèi)膜的粘附、侵襲、血管生成及增殖凋亡等過(guò)程[7]。

近年研究發(fā)現(xiàn)AKT能夠磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，其產(chǎn)物NO可以促進(jìn)血管生成，并發(fā)現(xiàn)EMS患者體內(nèi)eNOS表達(dá)明顯升高[8]，異位病灶周圍血管生成增多,可能都與AKT通路的激活有關(guān)[9-10]。Chang等[11]報(bào)道，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(NME1)的異常低表達(dá)，可激活A(yù)KT通路，進(jìn)而分泌大量IL-8和VEGF，促進(jìn)異位病灶處血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量生成。Govatati等[12]研究發(fā)現(xiàn)EMS在位內(nèi)膜中PTEN基因的缺失，使AKT通路過(guò)度激活，活化的AKT能夠抑制Bad活性，產(chǎn)生抑制凋亡作用，Bad屬于Bcl-2家族一員，具有促凋亡作用。

Cinar等[13]亦證實(shí)：EMS的女性在位內(nèi)膜AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路磷酸化水平高于無(wú)EMS的女性。Annu等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)：EMS中異位灶的粘附與生長(zhǎng)過(guò)程涉及多條信號(hào)通路的相互作用及協(xié)調(diào)，其中AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮了重要作用。

mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)中處于核心地位，其最主要的功能是調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。Leconte等[15]研究發(fā)現(xiàn)，深部浸潤(rùn)型EMS患者在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖率均明顯升高,認(rèn)為異位內(nèi)膜細(xì)胞的過(guò)度增殖和mTOR/AKT通路的激活有關(guān)，而mTOR/AKT抑制劑能有效抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖。

Feng等[16]腹腔鏡下觀察子宮內(nèi)膜異位病灶的特點(diǎn)為病灶周圍存在大量腹膜血管，組織學(xué)檢查子宮內(nèi)膜異位病灶的特點(diǎn)為高度的血管化。因此，新生血管在EMS形成的過(guò)程中起著重要的作用。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最為關(guān)鍵的血管形成因子，可與血管內(nèi)皮表面的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)血管的形成[17]。Kianpour等[18]研究發(fā)現(xiàn)EMS患者腹腔液及病灶中VEGF水平較正常對(duì)照組明顯升高，提示異位子宮內(nèi)膜病灶中VEGF的過(guò)度表達(dá)，可以增強(qiáng)血管的生成能力。

本課題通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，采用免疫組化及PCR檢測(cè)，證實(shí)EMS模型組大鼠在位、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白水平升高，顯著高于正?？瞻讓?duì)照組(P< 0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7-12, 19]，提示AKT、mTOR異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。EMS模型大鼠血清VEGF水平表達(dá)升高，提示與異位病灶的血管生成有關(guān)。而異位內(nèi)膜PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致異位內(nèi)膜侵襲、種植、生長(zhǎng)，共同促進(jìn)了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展。以上研究表明AKT/mTOR信號(hào)通路中的AKT、mTOR做為關(guān)鍵性的調(diào)控因子，可能在內(nèi)異癥的發(fā)病過(guò)程中起到“閘門”的作用。

同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究表明：溫經(jīng)止痛方可降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量，抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，溫陽(yáng)化瘀法中藥、孕三烯酮西藥可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并隨中藥濃度升高，其對(duì)VEGF分泌的抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性。本方可影響異位內(nèi)膜的粘附、侵襲，血管生成及增殖凋亡等過(guò)程；使在位子宮內(nèi)膜、異位子宮內(nèi)膜及腹腔局部微環(huán)境發(fā)生改變，抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)；從而達(dá)到治療EMS目的。如能進(jìn)一步研究其通路確切機(jī)制及上下游相關(guān)因子，可促進(jìn)研發(fā)靶向作用更強(qiáng)、臨床療效更好的中西藥。