不同時(shí)間睡眠干擾致小鼠體力疲勞模型的建立

黃 紅，姜 寧，呂靜薇，楊玉潔，陳碧清，王 瓊，劉新民*，呂光華，4*

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州 646000； 4.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都 611137)

疲勞是一種漸進(jìn)性主觀感受，造成疲勞的原因可分為生理性(即運(yùn)動(dòng)性)和心理性。生理(運(yùn)動(dòng))疲勞是肌肉暫時(shí)無(wú)法保持最佳的身體機(jī)能，并且會(huì)隨著劇烈的運(yùn)動(dòng)而越發(fā)嚴(yán)重的狀態(tài)[1-3]。根據(jù)1982年第五屆國(guó)際運(yùn)動(dòng)生化會(huì)議，運(yùn)動(dòng)性疲勞是指，機(jī)體生理過(guò)程不能持續(xù)其機(jī)能在一特定水平或各器官不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。在我國(guó)，40歲以上的白領(lǐng)階層中，75%屬于亞健康人群，40%主訴慢性疲勞[4]。因此，篩選具有抗疲勞或改善疲勞的保健食品/藥物，是當(dāng)今科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。目前，動(dòng)物研究中常見(jiàn)的疲勞模型主要有跑臺(tái)[5]、游泳[6]、束縛[7]、睡眠剝奪(水平臺(tái)法)[8]等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明滾筒法睡眠干擾(sleep interruption，SI)可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[9-10]和抑郁等腦力疲勞[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用滾筒法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行不同時(shí)間的睡眠干擾，研究造成小鼠體力疲勞的干擾強(qiáng)度，為體力疲勞慢性模型的建立和防護(hù)產(chǎn)品研發(fā)提供一種穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠48只，SPF級(jí)，體重21～23 g，5～6周齡，來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK (京) 2016-0006]。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK (京) 2018-0020]，倫理委員會(huì)審批號(hào)：SLXD-201803170028，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體重分為睡眠干擾5 d組、10 d組、15 d組和空白對(duì)照組，每組12只，自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)室安靜，溫度24℃，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(8:00 a.m.開(kāi)燈)。

1.2 主要試劑與儀器

血清尿素氮和肝糖原試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。大小鼠睡眠干擾儀、小鼠自主活動(dòng)實(shí)時(shí)測(cè)試分析處理系統(tǒng)、小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀、小鼠負(fù)重游泳測(cè)試分析系統(tǒng)均由北京康森益友公司、儀康科技(北京)有限公司聯(lián)合研制；變溫紫外-可見(jiàn)分光光度儀(Agilent Cary100，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 睡眠干擾實(shí)驗(yàn)

大小鼠睡眠干擾儀由滾筒和控制機(jī)箱兩部分組成。自行設(shè)定控制參數(shù)，使干擾儀以不同模式轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)滾筒內(nèi)飼養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)睡眠干擾。睡眠干擾組：先將睡眠干擾15 d組放入滾筒內(nèi)，5 d后將睡眠干擾10 d組放入滾筒內(nèi)，10 d后將睡眠干擾5 d組放入。滾筒直徑40 cm、長(zhǎng)22 cm，每個(gè)滾筒放一組動(dòng)物(12只)，滾動(dòng)參數(shù)為：3 r/min，每轉(zhuǎn)1 min，間隔1 min；在干擾造模時(shí)間點(diǎn)取出測(cè)試組進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，測(cè)試完畢后繼續(xù)放入滾筒進(jìn)行睡眠干擾，直至行為學(xué)檢測(cè)完全結(jié)束。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)

于滾筒法睡眠干擾第16天，采用轉(zhuǎn)輪式疲勞儀進(jìn)行測(cè)試，條件：轉(zhuǎn)速25 r/min、刺激電流0.2 mA[13]。轉(zhuǎn)輪底端有刺激電流，為避免電擊，小鼠必須保持跑動(dòng)狀態(tài)。當(dāng)小鼠力竭時(shí)，會(huì)跟不上轉(zhuǎn)輪速度，滑到轉(zhuǎn)輪底端，小鼠身體觸碰到整個(gè)電路造成短路，轉(zhuǎn)輪停止轉(zhuǎn)動(dòng)，儀器自動(dòng)記錄力竭時(shí)間。

1.3.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

于滾筒法睡眠干擾第17天將小鼠置于獨(dú)立自動(dòng)檢測(cè)的游泳箱中游泳，水溫(25 ± 0.5)℃[14]，鼠尾根部負(fù)荷10%體重的鉛皮[15]，水深≥ 25 cm。自動(dòng)記錄小鼠自游泳開(kāi)始至力竭時(shí)間段內(nèi)的行為。力竭時(shí)間從小鼠頭部沉入水中，經(jīng)7 s仍不能返回水面為止。游泳結(jié)束后，立即撈出小鼠，擦干小鼠身上的水分，放回原來(lái)的籠中。

1.3.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

于負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)前半個(gè)小時(shí)對(duì)各組小鼠禁食，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束半小時(shí)后，取血，4℃靜置4 h，低溫離心后，分取血清。小鼠脫臼處死，取肝組織以冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，于-80℃貯藏。血清尿素氮和肝糖原的含量按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠體重的影響

圖1顯示，經(jīng)過(guò)5, 10, 15 d睡眠干擾后，與對(duì)照組比較，睡眠干擾組體重均明顯降低(P< 0.05)。

注：SI，睡眠干擾；下圖同。小鼠每5 d稱重一次。各干擾組與對(duì)照組比較，*P < 0.05。圖1 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠體重的影響Note. SI, sleep interruption; the same in the following figures. Mice were weighed every 5 days. SI groups compared with the control group, * P < 0.05.Figure 1 Effect of different sleep interruption time on the body weight of mice

2.2 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠轉(zhuǎn)輪力竭時(shí)間的影響

由圖2可見(jiàn)，各睡眠干擾組與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)輪力竭時(shí)間差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，但呈現(xiàn)出干擾時(shí)間越長(zhǎng)，小鼠力竭時(shí)間減少的趨勢(shì)。

注：A：對(duì)照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。圖2 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠轉(zhuǎn)輪力竭時(shí)間的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.Figure 2 Effects of different sleep interruption times on the rotating wheel exhausted test time

2.3 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對(duì)照組比較，負(fù)重游泳力竭時(shí)間明顯縮短(P< 0.05，P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。下沉次數(shù)和下沉總時(shí)間反映了小鼠在負(fù)重游泳過(guò)程中的耐力，耐力程度與下沉次數(shù)和下沉總時(shí)間成正比。睡眠干擾10 d、15 d組與正常對(duì)照組比較，下沉次數(shù)和下沉總時(shí)間顯著減少(P< 0.01)；睡眠干擾5 d組與對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。

表1 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠負(fù)重游泳的影響Table 1 Effect of different sleep interruption times on loaded swimming

注：SI，睡眠干擾。與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. SI, sleep interruption. SI groups compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 慢性疲勞模型對(duì)小鼠血清尿素氮的影響

如圖3所示，睡眠干擾10 d和15 d組的血清尿素氮含量較空白對(duì)照組顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)。而干擾5 d組僅有上升趨勢(shì)，差異無(wú)顯著性。

注：A：對(duì)照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠血清尿素氮的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group.SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 3 Effects of different sleep interruption times on serum urea nitrogen in the mice

2.5 慢性疲勞模型對(duì)小鼠肝糖原的影響

如圖4所示，睡眠干擾5 d和10 d組的肝糖原含量較空白對(duì)照組顯著降低(P< 0.01)，睡眠干擾15 d組的肝糖原含量較空白對(duì)照組顯著降低(P< 0.05)。

注：A：對(duì)照組；B：干擾5 d組；C：干擾10 d組；D：干擾15 d組。與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 不同睡眠干擾時(shí)間對(duì)小鼠肝糖原的影響Note. A: Control group; B: SI 5 d group; C: SI 10 d group; D: SI 15 d group. SI groups compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Effects of different sleep interruption times on hepatic glycogen in the mice

3 討論

負(fù)重游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以直接反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度，本實(shí)驗(yàn)采用自主研發(fā)的小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，能采集除力竭時(shí)間外的其他評(píng)價(jià)小鼠耐力的指標(biāo)[14]。負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)中，睡眠干擾10 d、15 d組與空白對(duì)照組比較，首次下沉?xí)r間和首次連續(xù)下沉?xí)r間明顯縮短，但是差異無(wú)顯著性，主要是由于小鼠間存在個(gè)體差異；負(fù)重游泳力竭時(shí)間、下沉次數(shù)、下沉總時(shí)間等耐力性指標(biāo)顯著縮短，這說(shuō)明睡眠干擾10, 15 d均可造成小鼠運(yùn)動(dòng)耐力顯著下降。轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)中各睡眠干擾組與對(duì)照組比，呈現(xiàn)出干擾時(shí)間越長(zhǎng)，小鼠力竭時(shí)間越短的趨勢(shì)，但是差異無(wú)顯著性。推測(cè)本模型造模原理與轉(zhuǎn)輪相似，因此在轉(zhuǎn)輪評(píng)價(jià)小鼠耐力上不敏感。

糖原的含量能說(shuō)明疲勞發(fā)生的快慢或程度。肌糖原消耗的同時(shí)，為維持血糖水平，肝糖原儲(chǔ)備量減少[16]。尿素氮含量是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的重要產(chǎn)物之一，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加，機(jī)體能量代謝平衡被破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分解供能，血中尿素氮的含量增加。其與機(jī)體機(jī)能、疲勞程度呈正相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示睡眠干擾各組與空白對(duì)照組比較，睡眠干擾各組肝糖原含量均出現(xiàn)顯著降低；睡眠干擾10 d、15 d組較空白對(duì)照組的血清尿素氮含量顯著升高。說(shuō)明由于游泳力竭，小鼠機(jī)體代謝糖供應(yīng)不足，蛋白質(zhì)開(kāi)始分解供能。睡眠干擾5 d組僅造成了肝糖原與對(duì)照組相比降低，負(fù)重游泳和血清尿素氮檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明睡眠干擾5 d不能造成小鼠的體力疲勞。

綜合上述行為學(xué)和生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，ICR小鼠在滾筒式睡眠干擾所致慢性疲勞的行為學(xué)表現(xiàn)中，干擾10 d和15 d均可致小鼠表現(xiàn)出體力疲勞行為，進(jìn)一步完善后，將為睡眠障礙所致慢性疲勞的發(fā)病機(jī)制、篩選改善睡眠運(yùn)動(dòng)障礙所致體力疲勞藥物和保健品的研發(fā)提供一種穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。