鐵皮石斛內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究

徐迪，金日升，王海翔

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鐵皮石斛內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究

徐迪1，金日升2，王海翔3*

(1. 蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2. 合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，合肥 230009；3. 中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院，南京 211198)

為了解鐵皮石斛()內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物，從該真菌中分離得到15個(gè)化合物，經(jīng)波譜分析分別鑒定為-methyl-2-pyrolidinone (1)、環(huán)-(甘氨酸- l-脯氨酸) (2)、環(huán)-(d-丙氨酸-l-脯氨酸) (3)、環(huán)-(l-纈氨酸-l-脯氨酸) (4)、環(huán)-(l-亮氨酸-l-脯氨酸) (5)、cyclo-(l-Leu-d-4-hydroxyprolinyl) (6)、環(huán)-(l-苯丙氨酸-l-脯氨酸) (7)、環(huán)-(l-苯丙氨酸-l-4-羥基脯氨酸) (8)、環(huán)-(l-酪氨酸-l-脯氨酸) (9)、環(huán)-(l-苯丙氨酸-l-亮氨酸) (10)、啤酒甾醇 (11)、對(duì)羥基苯乙醇(12)、對(duì)羥基苯乙酸(13)、(2,3)-1-(4-羥基苯基)丁烷-2,3-二醇(14)和(2,3)-1-苯基丁烷-2,3-二醇 (15)。采用MTS法檢測(cè)抗腫瘤活性表明，化合物2、10和14對(duì)HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480細(xì)胞株具有一定的抑制活性。

鐵皮石斛；內(nèi)生真菌；化學(xué)成分；抗腫瘤活性

內(nèi)生真菌是一類在某一階段或完全生存于健康植物組織內(nèi)，而不引起植物組織明顯病變的微生物[1]。近年來(lái)，內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物研究備受關(guān)注，其結(jié)構(gòu)、生物活性的多樣性，尤其是在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有重要的潛力。目前從內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物種類涵蓋了萜類、醌類、生物堿、異香豆素類、苯并呋喃類、甾體和多肽化合物、酚類等，而利用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)抗癌藥物、殺蟲(chóng)劑、抑菌劑、植物激素、抗病毒劑、抗氧化劑、免疫抑制劑等均有研究報(bào)道[2–4]。

本文對(duì)鐵皮石斛中的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，利用現(xiàn)代色譜和波譜技術(shù)分離鑒定了15個(gè)化合物(圖1)。

1 材料和方法

1.1 材料

鐵皮石斛()植株于2016年7月采自安徽霍山，菌株分離自新鮮鐵皮石斛葉中，經(jīng)基因測(cè)序比對(duì)鑒定為(GenBank登錄號(hào): JX486129.1)，菌種保存于蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院。

HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7和SW480 腫瘤細(xì)胞株來(lái)自中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院。

1.2 儀器

質(zhì)譜由Agilent UPLC/Q-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定；核磁共振由Bruker AM-400、DRX 500和AVANCE Ⅲ- 600核磁儀測(cè)定；制備型MPLC儀器為Büchi公司生產(chǎn)(RP-18, 15 mm×230 mm ＆ 26 mm×460 mm); 半制備型HPLC為Waters 1525，色譜柱為Waters Xbridge (4.6 mm×150 mm, 5m)，Waters Sunfire (19 mm× 250 mm, 5m)；多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN FC); 正相柱層析硅膠(200~300目)由青島海洋化工廠生產(chǎn);反相柱層析硅膠為日本富士化工有限公司的RP-18 (45~70m)；Sephadex LH-20為瑞士Amershan Bio- sciences公司生產(chǎn)；所用試劑均為分析純或色譜純。

1.3 提取分離

將純化的內(nèi)生真菌菌株接種到經(jīng)高壓滅菌的PDA平板培養(yǎng)基上, 于28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)7 d。用滅菌后的6 mm打孔器取菌餅, 置于裝有400 mL PDB培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中, 共120瓶，放入振蕩培養(yǎng)箱中，于28℃下135 r min–1振蕩培養(yǎng)15 d，總發(fā)酵體積48 L。

將發(fā)酵液(48 L)用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液減壓濃縮得到固體浸膏28.5 g。總浸膏經(jīng)反相中壓色譜柱，甲醇-水[5∶95~100∶0,(下同)]梯度洗脫，得A~F共6個(gè)組分。組分A經(jīng)正相硅膠柱色譜, 二氯甲烷-甲醇(12∶1~2∶1)梯度洗脫, 再經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水35∶75~60∶40, 40 min)制備得到化合物14 (7.8 mg, 17 min)、13 (2.3 mg, 23 min)和15 (6.2 mg, 32 min)。組分B經(jīng)正相硅膠柱色譜石油醚-丙酮(5∶1~1∶1)梯度洗脫，得到B1~B3共3個(gè)亞組分；B3反復(fù)經(jīng)Sephadex LH-20柱丙酮洗脫純化得化合物12 (8.1 mg)；B2經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水42∶58~75∶25, 35 min)制備得到化合物6(5.2 mg,21 min)和5 (6.5 mg, 24 min)。組分C經(jīng)反相硅膠柱(40%, 60%, 80%, 100%甲醇)梯度洗脫，得到C1~C3共3個(gè)亞組分；C1經(jīng)正相硅膠色譜石油醚-丙酮(10∶1~2∶1)梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇1∶1)純化后，析出結(jié)晶，得到化合物11 (10.8 mg)；C2經(jīng)Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇1∶1)層析后，經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水45∶55~75∶25, 42 min)制備得化合物9 (4.8 mg, 20 min)、10 (5.7 mg, 23 min)和4 (4.1 mg, 31 min); C3經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水43∶57~72∶28, 36 min)制備得化合物2 (3.2 mg, 28 min)。組分D經(jīng)正相硅膠色譜石油醚-丙酮(10∶1~2∶1)梯度洗脫，再經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水48∶52~75∶25, 45 min)制備得化合物1 (2.4 mg, 19 min)和3 (1.8 mg, 25 min); 組分E經(jīng)正相硅膠色譜石油醚-丙酮(15∶1~3∶1)梯度洗脫, 再經(jīng)高效液相色譜(甲醇-水56∶44~68∶32,40 min)制備得化合物8 (2.1 mg, 26 min)和7 (1.5 mg, 32 min)。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末；ESI-MS: 122 [M + Na]+。1H NMR (CDCl3, 600 MHz):3.37 (2H, t,= 7.2 Hz, H-5), 2.80 (3H, s, N-CH3), 2.34 (2H, t,= 7.8 Hz,H-3), 2.01 (2H, m, H-4);13C NMR (CDCl3, 150 MHz):175.8 (C-2), 31.2 (C-3), 17.8 (C-4), 49.6 (C-5), 29.7 (CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，確定該化合物為-methyl-2-pyrolidinone。

化合物2 白色粉末；ESI-MS: 177 [M + Na]+。1H NMR (CD3OD, 600 MHz):4.22 (1H, t,= 8.8 Hz, H-6), 4.08 (1H, d,= 16.8 Hz, H-9a), 3.75 (1H, d,= 16.8 Hz, H-9b), 3.60 (2H, m, H-3), 2.37 (1H, m, H-5a), 2.06 (1H, m, H-5b), 1.94 (2H, m, H-4);13C NMR (CD3OD, 150MHz):166.4 (C-1), 46.8 (C-3), 23.4 (C-4), 29.5 (C-5), 59.8 (C-6), 171.9 (C-7), 47.5 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)-甘氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物3 白色針狀結(jié)晶；ESI-MS: 169 [M + H]+。1H NMR (CDCl3, 600 MHz):4.18 (2H, m, H-6, 9), 3.62 (2H, m, H-3), 2.38 (1H, m, H-4a), 2.10 (3H, m, H-4b, 5), 1.50 (3H, d,= 7.2 Hz, H-11);13C NMR (CDCl3,150 MHz):166.8 (C-1), 45.9 (C-3), 23.0 (C-4), 28.9 (C-5), 59.5 (C-6), 170.5 (C-7), 51.5 (C-9), 16.0 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致, 確定該化合物為環(huán)-(d)-丙氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物4 白色粉末；ESI-MS: 219 [M + Na]+。1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz):4.12 (1H, t,= 7.5 Hz, H-6), 3.89 (1H, s, H-9), 3.63 (1H, m, H- 3a), 3.52 (1H, m, H-3b), 2.58 (1H, m, H-4a), 2.39 (1H, m, H-4b), 1.90 (1H, m, H-10), 1.12 (3H, d,= 7.2 Hz, H-12), 0.94 (3H, d,= 7.2 Hz, H-11);13C NMR (CD3COCD3, 125 MHz):168.5 (C-1), 30.2 (C-3), 24.1 (C-4), 46.8 (C-5), 60.9 (C-6), 172.1 (C-7), 61.7 (C-9), 29.9 (C-10), 19.7 (C-11), 16.5 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-纈氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物5 白色粉末；ESI-MS: 233 [M + Na]+。1H NMR (CD3COCD3,400 MHz):4.11 (1H, dd,= 8.2, 8.2 Hz, H-6), 3.97 (1H, dd,= 3.1, 9.4 Hz, H-9), 3.50 (2H, m, H-3), 2.20 (2H, m, H-5), 1.98 (2H, m, H-4), 1.83 (1H, m, H-11), 1.57 (1H, m, H-10), 0.96 (6H, d,= 6.5 Hz, H-12, 13);13C NMR (CD3COCD3, 125 MHz):171.0 (C-1), 46.0 (C-3), 23.1 (C-4), 28.9 (C-5), 59.4 (C-6), 167.1 (C-7), 53.6 (C-9), 38.8 (C-10), 24.3 (C-11), 23.6 (C-12), 21.7 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-亮氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物6 白色粉末；ESI-MS: 249 [M + Na]+。1H NMR (CD3COCD3,400 MHz):4.48 (1H, m, H-8), 4.00 (1H, dd,= 5.8, 9.1 Hz, H-6), 3.86 (2H, m, H-3, 9a), 3.54 (1H, dd,= 4.6 Hz, 12.5 Hz, H-9b), 2.43 (2H, m, H-7), 1.78 (1H, m, H-11), 1.62 (2H, t,=6.9 Hz, H-10), 1.04 (3H, d,= 6.4 Hz, H-12), 0.96 (3H, d,= 6.4 Hz, H-13;13C NMR (CD3COCD3,125 MHz):166.9 (C-1), 54.5 (C-3), 68.0 (C-4), 38.3 (C-5), 56.7 (C-6),170.1 (C-7), 56.6 (C-9), 42.3 (C-10), 24.5 (C-11), 23.1 (C-12), 21.3 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，確定該化合物為Cyclo-(l)-leucine-[d-(4- hydroxyprolinyl)]。

化合物7 白色粉末；ESI-MS: 245 [M + H]+。1H NMR (CDCl3, 600 MHz):7.20~7.34 (5H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 4.38 (1H, dd,= 3.6, 10.0 Hz, H-9), 4.05 (1H, ddd,= 1.7, 6.3, 10.8 Hz, H-6), 3.54 (1H, m, H-3a), 3.40 (1H, m, H-3b), 3.26 (1H, dd,= 4.8, 15.0 Hz, H-10b), 3.07 (1H, dd,= 5.0, 14.4 Hz, H-10a), 1.78 (2H, m, H-4), 1.65 (1H, m, H-5a), 2.14 (1H, m, H-5b);13C NMR (CDCl3, 150 MHz):165.1 (C-1), 45.6 (C-3), 22.8 (C-4), 29.0 (C-5), 59.7 (C-6), 169.5 (C-7), 56.3 (C-9), 37.0 (C-10), 136.0 (C-1′), 129.5 (C-2′, 6′), 129.2 (C-3′, 5′), 127.4 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-苯丙氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物8 白色粉末；ESI-MS: 261 [M + H]+。1H NMR (CDCl3, 600 MHz):7.12~7.20 (5H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 4.54 (1H, brs, H-8), 4.45 (1H, ddd,= 2.0, 4.8, 5.3 Hz, H-9), 4.29 (1H, ddd,= 1.8, 4.8, 10.8 Hz, H-6), 4.26 (1H, t,= 4.8 Hz, H-4), 3.72 (1H, dd,= 4.8, 13.2 Hz, H-3b), 3.28 (1H, d,= 13.2 Hz, H-3a), 3.21 (1H, dd,= 4.8, 15 Hz, H-10b), 3.18 (1H, dd,= 5.4, 14.4 Hz, H-10a), 2.03 (1H, ddd,= 1.0, 5.4, 12.6 Hz, H-5a), 1.35 (1H, ddd,= 4.8, 10.8, 12 Hz, H-5b);13C NMR (CDCl3, 150 MHz):166.3 (C-1), 55.0 (C-3), 68.2 (C-4), 38.8 (C-5), 58.6 (C-6), 171.1 (C-7), 56.1 (C-9), 38.5 (C-10), 136.5 (C-1′), 130.2 (C-2′, 6′), 129.1 (C-3′, 5′), 127.7 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-苯丙氨酸- (l)-4-羥基-脯氨酸。

化合物9 白色粉末；ESI-MS: 261 [M + H]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz):7.02 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.13 (1H, s, H-8), 4.25 (1H, dd,= 2.9, 9.6 Hz, H-9), 4.08 (1H, t,= 7.6 Hz, H-6), 3.59 (2H, m, H-3), 3.41 (1H, dd,= 11.0, 14.0 Hz, H-10), 2.75 (1H, dd,= 9.6, 14.4 Hz, H-10), 2.34 (1H, m, H-5a), 1.96 (1H, m, H-5b), 1.86 (2H, m, H-4);13C NMR (CDCl3, 125 MHz):165.5 (C-1), 45.6 (C-3), 22.8 (C-4), 28.4 (C-5), 59.4 (C-6), 170.0 (C-7), 56.7 (C-9), 36.1 (C-10), 126.8 (C-1′), 130.5 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 156.2 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-酪氨酸-(l)-脯氨酸。

化合物10 白色粉末；ESI-MS: 243 [M + H]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz):7.16~7.32 (5H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 4.28 (1H, m, H-2), 3.82 (1H, m, H-5), 3.25 (2H, m, H-7), 1.54 (2H, m, H-14), 1.23 (1H, m, H-15), 0.82 (6H, t,= 6.4 Hz, H-16, 17);13C NMR (CDCl3, 125 MHz):56.9 (C-2), 171.5 (C-3), 54.0 (C-5), 168.3 (C-6), 43.1 (C-7), 135.5 (C-8), 130.0 (C-9), 129.2 (C-10), 116.2 (C-11), 128.2 (C-12), 130.9 (C-13), 40.9 (C-14), 24.3 (C-15), 23.3 (C-16), 21.2 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，確定該化合物為環(huán)(l)-苯丙氨酸-(l)-亮氨酸。

化合物11 白色針狀結(jié)晶；ESI-MS: 453 [M + Na]+。1H NMR (CDCl3, 600 MHz):5.68 (1H, brs, H-7), 5.25(1H, dd,= 14.9, 7.5 Hz, H-23), 5.15 (1H, dd,= 14.9, 7.5 Hz, H-24), 4.75 (1H, m, H-3), 4.30 (1H, brs, H-6), 1.46 (3H, s, H-19), 0.99 (3H, d,= 7.2 Hz, H-21), 0.89 (3H, d,= 6.8 Hz, H-28), 0.82 (3H, d,= 6.4 Hz, H-27), 0.80 (3H, d,= 6.5 Hz, H- 26), 0.65 (3H, s, H-18);13C NMR (CDCl3, 150 MHz):31.2 (C-1), 32.5 (C-2), 66.0 (C-3), 40.8 (C-4), 74.9 (C-5), 72.5 (C-6), 119.2 (C-7), 139.9 (C-8), 42.2 (C-9), 36.6 (C-10), 21.6 (C-11), 38.3 (C-12), 42.5 (C-13), 54.0 (C-14), 22.3 (C-15), 27.1 (C-16), 55.1 (C-17), 11.7 (C-18), 17.7 (C-19), 39.4 (C-14), 20.6 (C-21), 135.2 (C-22), 130.7 (C-23), 42.0 (C-24), 32.1 (C-25), 18.9 (C-26), 18.7 (C-27), 17.0 (C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，確定該化合物為啤酒甾醇。

化合物12 白色粉末；ESI-MS: 161 [M + Na]+。1H NMR (CD3OD, 400 MHz):7.01 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, H-6), 6.69 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, H-5), 3.69 (2H, t,= 7.2 Hz, H-8), 2.69 (2H, t,= 7.2 Hz, H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，確定該化合物為對(duì)羥基苯乙醇。

化合物13 白色針狀結(jié)晶；ESI-MS: 151 [M - H]–。1H NMR (CD3OD, 600 MHz):7.12 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, H-6), 6.73 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, H-5), 3.45 (2H, s, H-7);13C NMR (CD3OD, 125 MHz):128.3 (C-1), 131.0 (C-2, C-6), 116.2 (C-3, C-5), 157.5 (C-4), 42.5 (C-7), 176.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，確定該化合物為對(duì)羥基苯乙酸。

化合物14 淡黃色油狀物；[α]D20: -41.94 (1.130, CHCl3)；ESI-MS: 189 [M + Na]+。1H NMR (DMSO-d, 400 MHz):9.01 (1H, s, OH-4′), 7.02 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2′, 6′), 6.71 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 3.41 (1H, m, H-3), 3.35 (1H, m, H-2), 2.76 (1H, dd,= 13.6, 4.4 Hz, H-1a), 2.42 (1H, dd,= 13.6, 8.4 Hz, H-1b), 1.05 (3H, d,= 6.1 Hz, H-4);13C NMR (CD3OD, 125 MHz):38.7 (C-1), 76.8 (C-2), 69.8 (C-3), 19.1 (C-4), 130.8 (C-1′), 130.6 (C-2′, 6′), 115.1 (C-3′, 5′) 156.0 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，確定該化合物為(2,3)-1-(4-hydroxyl- phenyl)-butane-2,3-diol。

化合物15 淡黃色油狀物；[α]D20: +41.99 (1.124, CHCl3)；ESI-MS: 189 [M + Na]+。1H NMR (CDCl3, 400 MHz):7.25 (5H, m, C-1′, 2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 3.54 (1H, m, H-1a), 2.93 (1H, m, H-1b), 2.62 (1H, m, H-2), 2.16 (1H, m, H-3), 1.23 (3H, d,= 7.2 Hz, H-4);13C NMR (CDCl3, 125 MHz):40.6 (C-1), 78.4 (C-2), 71.9 (C-3), 18.2 (C-4), 141.5 (C-1′), 130.9 (C-2′,6′), 129.6 (C-3′, 5′), 127.2 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，確定該化合物為(2,3)-1-phenylbutane- 2,3-diol。

1.5 抗腫瘤活性試驗(yàn)

參照Wen等[20]的方法，取化合物2、4、5、6、9~12、14、15適量，用DMSO溶解，進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞HL-6、A-549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM或RMPI1640)配成單細(xì)胞懸液，以每孔3 000~15 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積 100L，貼壁細(xì)胞提前12~24 h接種培養(yǎng)。化合物以40mol L–1濃度初篩，每孔終體積200L，每化合物每種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)48 h后，貼壁細(xì)胞棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加MTS溶液20L和培養(yǎng)液100L；懸浮細(xì)胞棄100L培養(yǎng)上清液，每孔加20L的MTS溶液；設(shè)3個(gè)空白復(fù)孔，繼續(xù)孵育2~4 h，反應(yīng)充分后用多功能酶標(biāo)儀(MULTISKANFC)檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)下的光吸收值，數(shù)據(jù)處理后,以化合物編號(hào)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)繪制5株細(xì)胞的抑制率圖。試驗(yàn)均以順鉑(DDP)為陽(yáng)性化合物，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用兩點(diǎn)法(Reed and Muench法)計(jì)算化合物的IC50值。

從表1可見(jiàn)，化合物2、10、14對(duì)5種腫瘤細(xì)胞具有較弱的抑制活性?；衔?對(duì)HL-6、A-549和SW-480細(xì)胞的IC50分別為69.49、68.68和75.64mol L–1; 化合物10對(duì)HL-6、A-549、SMMC- 7721、MCF-7和SW-480細(xì)胞的IC50分別為67.82、84.98、91.08、89.88和64.93mol L–1; 化合物14對(duì)HL-6、A-549、SMMC-7721和MCF-7細(xì)胞的IC50分別為88.93、72.98、68.22和78.68mol L–1。

2 結(jié)果和討論

本研究利用正相硅膠色譜、Sephadex LH-20、制備型高效液相等色譜手段，從內(nèi)生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離得到15個(gè)化合物，分別鑒定為-methyl-2-pyrolidinone (1)、環(huán)-甘氨酸-(l)-脯氨酸 (2)，環(huán)-(d)-丙氨酸-(l)-脯氨酸(3)，環(huán)(l)-纈氨酸- (l)-脯氨酸(4)，環(huán)(l)-亮氨酸-(l)-脯氨酸(5), cyclo- (l)-leucine-[d-(4-hydroxyprolinyl)] (6)，環(huán)(l)-苯丙氨酸-(l)-脯氨酸(7)，環(huán)(l)-苯丙氨酸-(l)-4-羥基-脯氨酸(8)，環(huán)(l)-酪氨酸-(l)-脯氨酸(9)，(l)-苯丙氨酸- (l)-亮氨酸(10)，啤酒甾醇 (11)，對(duì)羥基苯乙醇(12)，對(duì)羥基苯乙酸(13), (2,3)-1-(4-hydroxyphenyl)butane-2,3-diol (14)，(2,3)-1-phenylbutane-2,3-diol (15)。體外抗腫瘤活性測(cè)試表明，化合物2、10、14具有一定的腫瘤抑制活性。

表1 化合物的抗腫瘤活性[IC50 (μmol L–1)]

本次從內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離得到的天然產(chǎn)物多為環(huán)肽和苯環(huán)衍生物，推測(cè)為微生物發(fā)酵產(chǎn)物，并未發(fā)現(xiàn)與內(nèi)生菌宿主體內(nèi)相同或相似的化學(xué)成分，對(duì)此還需進(jìn)一步研究探索；但活性研究表明，小分子環(huán)肽也具有一定的抗腫瘤活性。微生物發(fā)酵產(chǎn)物或許存在潛在的生物活性，值得引起進(jìn)一步關(guān)注。

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Study on Secondary Metabolites of Endophytic Fungusfrom

XU Di1, JIN Ri-sheng2, WANG Hai-xiang3*

(1. Wuhu Institute of Technology, Wuhu 241000, Anhui, China; 2. Engineering Research Center of Bioprocess Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 3. School of Engineering, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

In order to understand the chemical constituents of endophytic fungusfrom, fifteen compounds were isolated. On the basis of spectral data, their structures were identified as-methyl-2-pyrolidinone (1), cyclo-(glycine-l-proline) (2), cyclo-(d-alanine-l-proline) (3), cyclo- (l-valine-l-proline) (4), cyclo-(l-leucine-l-proline) (5), cyclo-(l-leucine-d-4-hydroxyprolinyl) (6), cyclo-(l- phenylalanine-l-proline) (7), cyclo-(l-4-hydroxyproline-l-phenylalanine) (8), cyclo-(l-tyrosine-l-proline) (9), cyclo-(l-phenylalanine-l-leucine) (10), beer sterol (11),-hydroxyphenylethanol (12),-hydroxyphenylacetic acid (13), (2,3)-1-(4-hydroxyphenyl)butane-2,3-diol (14), and (2,3)-1-phenylbutane-2,3-diol (15). The MTS assay showed that compounds 2, 10 and 14 had weak inhibitory activities against five human tumor cell lines, such as HL-60, A-549, SMMC-7721, MCF-7, and SW-480.

;; Chemical constituent; Antitumour activity

10.11926/jtsb.3928

2018-04-16

2018-07-04

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A762)；高校優(yōu)秀青年骨干人才國(guó)內(nèi)訪問(wèn)研修項(xiàng)目(gxgnfx2018100)資助

This work was supported by the Key Project for Natural Science of Department of Education in Anhui Province (Grant No. KJ2016A762), and the Project for Domestic Excellent Training of Outstanding Young Talents in Colleges and Universities (Grant No. gxgnfx2018100).

徐迪(1983~ )，男，講師，從事微生物發(fā)酵工程與技術(shù)。E-mail: 89717860@qq.com

E-mail: wangsky111@yeah.net