廣東省中山市五桂山土沉香空間遺傳結(jié)構(gòu)

劉盼盼, 廖浩斌, 蔣謙才, 譚宗健, 孫紅梅, 王瑞江, 曹洪麟, 黃向旭, 賴思茹, 梁丹, 王崢峰*

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廣東省中山市五桂山土沉香空間遺傳結(jié)構(gòu)

劉盼盼1, 廖浩斌1, 蔣謙才1, 譚宗健1, 孫紅梅1, 王瑞江2, 曹洪麟2, 黃向旭2, 賴思茹2, 梁丹2, 王崢峰2*

(1. 中山市國有森林資源保護(hù)中心，廣東 中山 528400；2. 中國科學(xué)院華南植物園, 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650)

為了解五桂山的土沉香()種群空間遺傳結(jié)構(gòu)，利用18個微衛(wèi)星位點(diǎn)對143株胸高直徑大于5 cm的土沉香個體基因型進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，五桂山土沉香種群的觀測雜合度和期望雜合度均為0.534；近交系數(shù)為0.000 1，說明五桂山土沉香遺傳多樣性并不低，且種群處于隨機(jī)交配狀況?？臻g遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，五桂山土沉香缺乏空間遺傳結(jié)構(gòu)，不同遺傳背景的個體相互混雜，導(dǎo)致相鄰個體遺傳差異較大。這可能是五桂山土沉香種群發(fā)育過程中自疏所致，也可能是這一地區(qū)土沉香為人工種植，而非自然發(fā)育形成而造成的。

土沉香；微衛(wèi)星位點(diǎn); 遺傳多樣性; 遺傳景觀圖; 空間主成分分析法; 空間自相關(guān)法

土沉香[(Lour.) Gilg]，又稱白木香、香樹、女兒香、牙香樹，為瑞香科(Thyme- laeaceae)沉香屬植物，分布于我國熱帶、亞熱帶地區(qū)，為多年生常綠喬木，中國特有。土沉香是一種珍貴的香料和中藥資源[1]。作為香料，自古以來就有“沉檀龍麝”之說，其中的“沉”，就是指沉香，其香品高雅，被列為眾香之首。作為藥材，其功效主要有理氣調(diào)中、壯陽除痹、行氣止痛和納氣平喘,被列為十大廣藥之一。

土沉香渾身都是寶，用途非常廣泛。除了作為名貴藥材和天然香料，其種子可制肥皂、潤滑油,有重要的工業(yè)用途；樹皮可用來造紙和生產(chǎn)人造棉。同時，沉香樹為主根向下生長之深根系弱陽性樹種，是最好的水土保護(hù)者。沉香生長過程中，不需噴灑農(nóng)藥，不會危害土質(zhì)和人體的健康，有益于生態(tài)維護(hù)。沉香又是中國悠久歷史文化的產(chǎn)物，它起源于唐之前，經(jīng)歷各朝代，從香案、香囊、香袋、香木雕品及薰香等，處處體現(xiàn)了土沉香包含的文化底蘊(yùn)。因此，土沉香具有十分重要的科研價值、經(jīng)濟(jì)價值、生態(tài)價值和文化價值。

由于沉香的重要經(jīng)濟(jì)價值，致使其野生資源被掠奪性采伐，破壞嚴(yán)重。為保護(hù)這一珍貴野生種質(zhì)資源，土沉香被《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》(1999)列為國家二級保護(hù)植物，同時被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)》列為禁止貿(mào)易的物種資源。

土沉香的種植與沉香文化具有悠久的歷史，源遠(yuǎn)流長。廣東省中山市是土沉香種植和文化產(chǎn)業(yè)的重要區(qū)域。中山市古稱香山，地屬東莞縣文順鄉(xiāng), 這一地區(qū)出產(chǎn)的沉香被稱為“莞香”，是上乘進(jìn)貢極品，因而中山市享有“中國沉香之鄉(xiāng)”美譽(yù)[2–3]。作為古代莞香主要產(chǎn)地，中山市五桂山地區(qū)土壤和氣候條件俱佳，至今仍遺留有豐富的土沉香種質(zhì)資源，極具保護(hù)和利用價值[4]。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成，是物種適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化發(fā)展的源泉。因此，了解、保護(hù)和維持物種的遺傳多樣性具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。空間遺傳結(jié)構(gòu)是物種遺傳多樣性在空間分布的狀況，是物種生活史特征(交配系統(tǒng)、擴(kuò)散)和環(huán)境因素(種間競爭、生境選擇)多方面作用下形成的特定結(jié)構(gòu)形式，在反映物種進(jìn)化歷史、生境適應(yīng)方面具有重要作用[5–7]。

為此，本文在前期五桂山地區(qū)土沉香遺傳多樣性研究[8]的基礎(chǔ)上，通過增加采樣量，對中山市五桂山的土沉香空間遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為這一地區(qū)的土沉香種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)提供相關(guān)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究地點(diǎn)和樣品采集

土沉香[(Lour.) Gilg]采樣地點(diǎn)位于廣東省中山市五桂山生態(tài)保護(hù)區(qū)內(nèi)[8], 在非常熟悉五桂山保護(hù)區(qū)內(nèi)土沉香分布的當(dāng)?shù)刈o(hù)林員幫助下，沿著林中小路進(jìn)行樣品采集，基本覆蓋土沉香主要分布區(qū)，對胸徑(diameter at breast height, DBH)大于5 cm的土沉香個體，采集2~3片葉，放入裝有硅膠的密封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理，所采集的土沉香植株數(shù)量占現(xiàn)有分布數(shù)量的90%以上。野外觀察表明，DBH大于5 cm的土沉香已可以開花結(jié)實(shí)。對每株采樣個體進(jìn)行GPS定位(圖1)，并測定DBH, 共采集143株土沉香的葉片，DBH主要為10~30 cm (圖2)。為了解年齡級對空間遺傳結(jié)構(gòu)的影響，按照土沉香胸高直徑分布，把樣株分成2個年齡級：年齡級I，胸高直徑小于20 cm (76株); 年齡級II，胸高直徑大于20 cm (67株)。

1.2 遺傳多樣性檢測

參考蔣謙才等[8]的18個微衛(wèi)星位點(diǎn)和方法對所有土沉香進(jìn)行基因型分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlEx 6.501[9]和Genepop-4.5.1[10]軟件分別計算五桂山土沉香各位點(diǎn)和種群等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度和近交系數(shù)()[11]。采用Bonferroni糾正的方法進(jìn)行多重比較下的顯著性水平調(diào)整[12]。其中，近交系數(shù)值反映位點(diǎn)或種群是否處于哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium,一種自由交配狀況)，值為0表明位點(diǎn)或種群處于平衡狀態(tài)。

空間遺傳結(jié)構(gòu)分析首先采用遺傳景觀圖(genetic landscape shapes, GLS)方法[13], 先構(gòu)建所有個體間的德勞內(nèi)三角網(wǎng)格圖，然后對每個網(wǎng)格圖計算個體間的遺傳距離，最后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法把每個網(wǎng)格對應(yīng)的遺傳距離反映在空間格局上，反映局部空間個體間的相似性。

再采用Jombart等[14]開發(fā)的sPCA (spatial principal component analysis)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 其整合了空間和主成分分析(principle component analysis, PCA)方法，可有效揭示不同尺度空間上個體間的遺傳相似程度。sPCA分析同時可以對個體在空間上的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)進(jìn)行顯著程度的檢測, 正相關(guān)被稱為全局檢驗(yàn)，負(fù)相關(guān)被稱為局部檢驗(yàn)。兩者的顯著度檢驗(yàn)采用對比999次隨機(jī)重復(fù)結(jié)果獲得。

最后利用GenAlEx 6.501進(jìn)行遺傳多樣性的空間自相關(guān)分析(spatial autocorrelation analysis)，探討個體間的遺傳相似性隨地理距離變化的狀況。由于個體間地理距離變化較大(0.9~1 638.3 m)，采用非均勻地理尺度，包括了大小不同地理尺度，以全面了解不同尺度下五桂山土沉香空間自相關(guān)狀況。

2 結(jié)果和分析

18個微衛(wèi)星位點(diǎn)在五桂山土沉香種群中分別擴(kuò)增出2~14個等位基因，觀測雜合度為0.063~ 0.797，期望雜合度為0.075~0.802 (表1)，近交系數(shù)表明所有位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格平衡。種群整體觀測雜合度和期望雜合度都為0.534，近交系數(shù)也接近0，表明種群整體處于哈迪-溫伯格平衡。

從年齡級來看，年齡級I的整體觀測雜合度為0.526，期望雜合度為0.530；年齡級II的整體觀測雜合度為0.542，期望雜合度為0.539。兩個年齡級的近交系數(shù)分別為0.0075和-0.0070，都接近0。

GLS分析結(jié)果表明，五桂山土沉香只有東北和西南部小部分個體間有較小的遺傳距離(圖3)。不同年齡級的GLS結(jié)果(圖略)均和整體結(jié)果一致。

根據(jù)sPCA計算的特征向量值(圖4)，前兩個正向量分別解釋了10.380%和6.682%的遺傳變異。從第一向量來看(圖5: A)，除東北方向的土沉香個體間遺傳相似性較大，形成比較單純的聚集外，其他地區(qū)沒有明顯的遺傳相似度較大的個體間形成地理聚集狀況，并出現(xiàn)遺傳差異較大的個體在同一地區(qū)混雜；第二向量(圖5: B)也表明遺傳差異較大的個體相互混雜分布，沒有明顯的地理聚集群。正相關(guān)和負(fù)相關(guān)顯著度檢測值()分別為0.094和0.907，表明不存在明顯的空間相關(guān)性。不同年齡級第一向量和第二向量中的第一軸和第二軸均反映出不同遺傳差異個體的混雜(圖略)，與整體分析結(jié)果一致。

空間自相關(guān)分析結(jié)果表明，五桂山土沉香整體上缺乏空間遺傳結(jié)構(gòu)，在不同空間尺度上表現(xiàn)為隨機(jī)狀況(圖6)。兩個年齡級也均表現(xiàn)出缺乏空間遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果(圖略)。

3 討論

我們前期對中山市五桂山土沉香遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究，觀察雜合度和期望雜合度分別為0.523和0.522[8]，本次增加了采集量，基本覆蓋了五桂山土沉香生長分布區(qū)。相比之下，隨著樣品量的增加，整體遺傳多樣性略有增加，觀察雜合度和期望雜合度都為0.534。但兩次的近交系數(shù)都接近0，表明五桂山土沉香種群整體處于隨機(jī)交配狀況。

表1 土沉香18個微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性

表2 五桂山土沉香兩個年齡級的遺傳多樣性

: 等位基因數(shù);H: 觀測雜合度;H: 期望雜合度;: 近交系數(shù)。

: Numble of alleles;H: Observed heterozygosity;H: Expected heterozygosity;: Inbreeding index.

除了遺傳多樣性，空間遺傳結(jié)構(gòu)也是反映種群維持狀況的一個重要方面。遺傳多樣性大小是物種生活史特征及其進(jìn)化歷史過程的綜合反映，其大小與物種的適應(yīng)進(jìn)化、瀕危狀況等有著一定的相關(guān)性[15–16]。但物種由不同地理種群組成，而種群又是由不同個體組成。這些種群或者個體分布在不同地理位置上，所處的景觀格局、生境狀況可能千差萬別，不同的生物和非生物因子作用于不同的種群或個體上，會造成不同地理來源、分布點(diǎn)的種群或個體遺傳變異的差異。因此，僅僅進(jìn)行物種或種群遺傳多樣性大小的研究不能全面把握物種遺傳變異狀況。而空間遺傳結(jié)構(gòu)作為了解遺傳變異與種群或個體地理位置相關(guān)狀況，有助于更深入探討物種遺傳多樣性形成，為物種的合理保護(hù)和經(jīng)營提供指導(dǎo)。對于植物而言，花粉和種子擴(kuò)散狀況是決定其空間遺傳結(jié)構(gòu)的首要方面，其中種子擴(kuò)散更具有主導(dǎo)性[7]。

土沉香是蟲媒花，傳粉者主要是蛾類，如螟蛾(Pyralids)和夜蛾(Noctuids)[17]。雖然這些昆蟲在土沉香中的傳粉距離還沒有研究，但有研究表明這些昆蟲的傳粉距離可能較長(1 000 m或更遠(yuǎn))[18–21]。但由于蟲媒花需要昆蟲等的幫助，花粉流狀況有更多不確定性, 如受昆蟲種群大小、昆蟲本身運(yùn)動能力、景觀格局的影響[21–23]。土沉香的種子為卵圓形，黑褐色，長度約14 mm，寬度約5 mm，重約0.14 g[24], 除種子本體還附著一附屬物，附屬物可以分泌化學(xué)信號，引誘多種胡蜂前來取食, 胡蜂取食過程中一定程度上會協(xié)助土沉香種子傳播。但在野外觀察,能被胡蜂成功攜帶遠(yuǎn)距離傳播的種子很有限，大部分種子還是依靠重力傳播，散落在母樹周圍，因此土沉香的種子有重力和攝食傳播兩種方式[1,24]。胡超[24]曾認(rèn)為胡蜂可以協(xié)助土沉香擴(kuò)散到500 m遠(yuǎn)。對同屬馬來沉香(.)的研究表明，種子唯一傳播者黃腰胡蜂()可以最遠(yuǎn)擴(kuò)散到500 m以外[25]。除了胡蜂，是否還有其他動物或鳥類協(xié)助土沉香種子擴(kuò)散還需進(jìn)一步研究。土沉香種子的傳播距離應(yīng)在100 m以內(nèi)，野外觀察到土沉香母樹的種子多是直接落在其附近，并在母樹旁發(fā)芽，表明土沉香種子的擴(kuò)散以重力居多。土沉香花粉和種子雖然有長距離傳播的可能或情形，但多數(shù)情況下擴(kuò)散有限，易于形成一定的空間遺傳結(jié)構(gòu),即遺傳相似性的個體呈聚集分布。

同時，利用不同分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行的土沉香不同種群遺傳分化研究表明，不同地區(qū)土沉香種群間遺傳分化較大[26–27]。黃久香等[26]采用ISSR (inter-simple sequence repeat)分子遺傳標(biāo)記對廣東東莞、電白和廣西玉林的土沉香種群遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這些種群間遺傳分化為0.227；賈文杰等[1]采用ISSR分子標(biāo)記對廣東、廣西、云南和海南地區(qū)8個種群的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明土沉香種群間的遺傳分化達(dá)0.443。當(dāng)遺傳分化為0.15~0.25時，種群間的遺傳分化程度較大; 當(dāng)遺傳分化大于0.25時，種群間的遺傳分化程度很大[27]。因此，土沉香種群間出現(xiàn)了較大的遺傳分化，說明土沉香花粉或種子擴(kuò)散能力有限。

本研究結(jié)果表明，五桂山土沉香種群缺乏空間遺傳結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)一些遺傳差異較大的個體混雜的情況。在種群發(fā)育過程中，種群不同年齡級個體表現(xiàn)出不同的遺傳結(jié)構(gòu)[28–34]。祁彩虹等[28]對浙江省天臺上甜櫧()種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明有3個低年齡級都在小距離尺度上表現(xiàn)出較強(qiáng)的空間遺傳結(jié)構(gòu)，而大年齡級個體在不同空間距離尺度上均沒有表現(xiàn)出空間遺傳結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為這是甜櫧種子擴(kuò)散有限造成，即有限的種子擴(kuò)散距離導(dǎo)致遺傳相似度大的低齡個體聚集在母樹周圍，引起空間遺傳結(jié)構(gòu)的發(fā)生；而在幼苗或小樹長大后，個體間的競爭導(dǎo)致自疏作用發(fā)生，從而降低了大年齡級個體的空間遺傳結(jié)構(gòu)。Berens等[29]在肯尼亞對非洲李()的研究中也有類似的結(jié)果。但受到種子遠(yuǎn)距離擴(kuò)散能力強(qiáng)、人類干擾等因素的影響，這種隨年齡級而空間遺傳結(jié)構(gòu)逐漸變小的趨勢并不一定會出現(xiàn)[32–34]。五桂山土沉香2個年齡級同樣缺乏遺傳結(jié)構(gòu)，由于我們采集的土沉香為胸徑大于5 cm的成年個體，可能是種群個體生長過程中自疏作用導(dǎo)致缺乏空間遺傳結(jié)構(gòu)，即圍繞母樹具有較高遺傳相似度的個體(如全同胞或半同胞)在成長為大樹過程中存在相互競爭，致使具有遺傳差異較大的個體能相互共存。

同時，由于缺乏歷史資料，雖然現(xiàn)有五桂山土沉香種群散布在次生林中，且有些個體胸徑較大(58.2 cm)，但種群整體起源狀況并不明晰。經(jīng)過咨詢當(dāng)?shù)亓謽I(yè)管理部門、農(nóng)戶，對于五桂山土沉香來源也沒有相關(guān)資料憑證，大致認(rèn)為這一地區(qū)土沉香資源很豐富，大樹又很多，分布也很分散，一般不會是人工種植的。但考慮到中山市及其五桂山地區(qū)歷史上是土沉香主產(chǎn)區(qū)，人工種植廣泛，而且建國以來也開展過一些國土綠化工程，土沉香作為優(yōu)良樹種也會被用于進(jìn)行林地改造等。因此，如果存在不同種源的人為種植，也會導(dǎo)致五桂山地區(qū)土沉香種群空間遺傳結(jié)構(gòu)的缺乏。

在空間遺傳結(jié)構(gòu)研究中，不同的空間采樣方式會對結(jié)果有一定的影響[35–37]。采樣方式大致包括了全部取樣法、隨機(jī)取樣法(包括整體隨機(jī)取樣法、分組后組內(nèi)隨機(jī)法)、均勻取樣法(按照網(wǎng)格等距離取樣)、線性取樣以及混合取樣(包括上述各種取樣)。通常，由于物種種群個體數(shù)量較大，能全部采樣的狀況非常少。而對于只能部分采樣的狀況，Schwartz等[36]的研究表明，除非物種種群個體遺傳變異在空間上完全隨機(jī)分布，否則沒有任何一種部分取樣方式的研究結(jié)果上沒有偏差。Zeng等[37]在青藏高原對墊狀點(diǎn)地梅()空間遺傳結(jié)構(gòu)的研究表明，對于整體隨機(jī)取樣法、分組后組內(nèi)隨機(jī)法以及線性取樣3種方法，線性取樣的研究結(jié)果略好,一是誤差小，二是采樣方式開支較少。

本研究的目的在于反映整個五桂山土沉香的空間遺傳結(jié)構(gòu)狀況，因此采用沿山林小路全部取樣的方式，保證了每個有土沉香的分布點(diǎn)均有樣品采集。我們的采樣類似于線性取樣(圖1)，與隨機(jī)取樣相比，保證取樣密度較大，可以反映更細(xì)致的空間遺傳結(jié)構(gòu)狀況。而對于均勻取樣，需要清楚掌握分布區(qū)內(nèi)種群個體分布狀況后才能很好設(shè)計網(wǎng)格進(jìn)行采樣，均勻取樣雖然保證了樣品分布的均勻性,但也會犧牲一定的細(xì)致度，取樣密度低于全部取樣。目前對五桂山土沉香的分布了解還局限在林道周圍，對于群落中是否包含更多的土沉香資源有待進(jìn)一步踏查和研究。

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Spatial Genetic Structure ofin Wuguishan, Zhongshan, Guangdong Province

LIU Pan-pan1, LIAO Hao-bin1, JIANG Qian-cai1, TAN Zong-jian1, SUN Hong-mei1, WANG Rui-jiang2, CAO Hong-lin2, HUANG Xiang-xu2, Lai Si-ru2, Liang Dan2, WANG Zheng-feng2*

(1. Zhongshan State-owned Forest Resources Protected Center, Zhongshan 528407, Guangdong, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

In order to understand the spatial genetic structure ofin Wuguishan, Zhongshan City, Guangdong Province, the genotypes of 143 individuals of.with DBH (diameter at breast height) more than 5 cm were determined by using 18 microsatellite loci. The results showed that the observed heterozygosity and expected heterozygosity of.populationwere all 0.534, and inbreeding coefficient was 0.000 1, which indicated that the genetic diversity of.in Wuguishan was not low, and the whole population was under random mating situation. The genetic landscape shapes, spatial principal components analysis (sPCA) and spatial autocorrelation analysis showed.in Wuguishan lack spatial genetic structure. The individuals with different genetic backgrounds mixed, so that the neighbors had high genetic differences. So, it was suggested that the self thinning and artificial planting of.could be the two possible reasons.

; Microsatellite loci; Genetic diversity; Genetic landscape shape; Spatial principle component analysis; Spatial autocorrelation analysis

10.11926/jtsb.3917

2018-03-30

2018-06-01

中山市財政局資金項(xiàng)目; 東莞市科技項(xiàng)目(2015108101002); 廣東省科技計劃項(xiàng)目(2017A030303060); 廣東省林業(yè)廳中藥材保護(hù)項(xiàng)目; 廣東省林業(yè)廳野生動植物保護(hù)和濕地保護(hù)專項(xiàng)資金(2130299); 廣東省野生動植物保護(hù)管理項(xiàng)目資助

This work was supported by the Project in Zhongshan Finance Bureau, the Project for Science and Technology in Dongguan City (Grant No. 2015108101002), the Project for Science and Technology in Guangdong Province (Grant No. 2017A030303060), the Project for Conservation of Traditional Chinese Medicine in Forestry Administration of Guangdong, the Special Project for Conservation of Wild Animals, Plants and Wetlands in Forestry Administration of Guangdong (Grant No. 2130299), and the Project for Conservation and Management of Wild Animals and Plants in Guangdong Province.

劉盼盼(1986~ ), 女, 碩士, 林業(yè)工程師, 主要研究方向林業(yè)保護(hù)。E-mail: 769936661@qq.com

E-mail: wzf@scib.ac.cn