自擬放射性腸炎灌腸液灌腸對急性放射性腸炎小鼠腸道黏膜屏障損傷的預防及治療作用觀察

汪濤，劉梅，楊華良，李德冠

(1天津市中心婦產科醫(yī)院，天津300100;2北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所)

腫瘤切除術后盆腔內、外放射治療是治療女性子宮頸癌及子宮內膜癌的重要輔助手段［1]，而盆腔惡性腫瘤放療野因包含消化道結構，而消化道上皮細胞的增殖活躍，易受到放、化療的影響，進而出現(xiàn)小腸、結腸和直腸等消化道不良反應，這些不良反應會限制患者放、化療的最大耐受劑量，降低治療效果。輕者癥狀可耐受并能自行愈合，重者癥狀持續(xù)較長時間且伴有出血、狹窄或形成瘺，嚴重者可導致患者死亡［2，3]。放療不良反應可發(fā)生在治療中任意時間，腸道急性不良反應常發(fā)生于治療前幾周，數(shù)月或數(shù)年后會發(fā)生慢性損傷，而晚期不良反應往往代表持久而不可逆的放療相關組織改變［4]。目前臨床對于放射性腸道損傷的藥物治療主要為對癥，2018年《中國放射性直腸炎診治專家共識》［5]中推薦的藥物治療方案包括腸炎急性期使用柳氮磺胺吡啶等藥物，使用抗生素、益生菌、洛哌丁胺等口服治療腹瀉癥狀，使用硫糖鋁、糖皮質激素等保留灌腸治療出血。最新研究［6，7]認為，中藥是預防與治療放射性腸炎的有效方法之一，特別是中藥保留灌腸，灌腸液一方面可直接注入直腸，在腸黏膜處直接吸收，藥物局部濃度高，起效快;另一方面，藥物混合于直腸液中，經(jīng)直腸靜脈直接進入體循環(huán)，避免肝臟首過效應，在發(fā)揮局部治療作用的同時還具有全身治療作用［8]。為此，我們依據(jù)中醫(yī)理論證型自擬放射性腸炎灌腸組方，并觀察其灌腸對急性放射性腸炎模型小鼠腸道黏膜屏障修復及治療作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器 C57BL/6J小鼠64只，SPF級，雌性，購自北京華阜康生物科技有限公司，體質量20.0～22.0 g。所有動物均在同等條件下飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。自擬放射性腸炎灌腸液組方為黃芩、黃連、黃柏、白花蛇舌草、白頭翁、蒲公英、粉葛、秦皮、生地榆、敗醬草、烏藥、延胡索。

1.2 急性放射性腸炎模型制備及自擬放射性腸炎灌腸液灌腸方法 小鼠隨機分為對照組、照射組、預防組和治療組，每組各16只。對照組不予照射，照射組、預防組和治療組接受腹部局部12 Gy(137Cs γ射線輻射源，購自加拿大原子能有限公司，劑量率為0.99 Gy/min)照射1次制備急性放射性腸炎模型。預防組在照射前3天起用自擬放射性腸炎灌腸，1次/d，造模當日繼續(xù)灌腸4 d，共灌腸7次;治療組在造模當日當日用自擬放射性腸炎灌腸，1次/d，共灌腸7次;對照組、照射組自造模當日均予等量生理鹽水灌腸，共灌腸7次。灌腸方法為由肛門插入軟管約4 cm，然后注入灌腸液0.3 mL(經(jīng)人－鼠等效量折算［9])，留置20 s后拔出灌腸器，再將小鼠倒置30 s，小鼠無需麻醉。

1.3 各組小鼠小腸組織隱窩細胞數(shù)及絨毛形態(tài)、長度測算 造模第3天時各組均取6只小鼠，頸椎脫臼處死小腸組織制作石蠟塊。采用蘇木素－伊紅法進行HE染色，Image J 1.37分析軟件測算各組小腸絨毛隱窩細胞數(shù)。另取部分小腸組織，免疫組化Villin染色后抗原微波修復，封片，Image J 1.37分析軟件觀察小腸絨毛形態(tài)、測算小腸絨毛長度。重復3次，取平均值。

1.4 各組小鼠生存情況觀察 觀察各組小鼠造模第15天時生存情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小腸組織隱窩細胞數(shù)比較 對照組小腸隱窩深遂，而照射組小腸隱窩排列發(fā)生變化，隱窩深度降低，預防組和治療組隱窩排列情況要優(yōu)于照射組。

對照組、照射組、預防組和治療組小腸組織隱窩細胞數(shù)分別為(16.90 ± 5.55)、(6.90 ± 3.51)、(10.30 ±2.21)、(3.40 ±2.91)個/cm，與對照組比較，照射組、預防組和治療組小鼠小腸組織隱窩細胞數(shù)降低(P均＜0.05)，與照射組比較，預防組小鼠小腸組織隱窩細胞數(shù)升高，治療組小腸組織隱窩細胞數(shù)降低(P均＜0.05)。

2.2 各組小腸組織絨毛形態(tài)及長度比較 對照組小腸絨毛上皮細胞整齊，形態(tài)正常，排列有序，腺體豐富。照射組小腸絨毛長度明顯比對照組腸絨毛長度減少，照射組明顯比預防組腸絨毛長度少，見圖2。對照組、照射組、預防組和治療組小腸組織絨毛長度分別為(585.32 ±21.39)、(227.22 ±44.36)、(386.43 ±56.48)、(189.42 ±39.90)μm，與對照組比較，照射組、預防組和治療組小腸組織絨毛長度降低(P均＜0.05)，與照射組比較，預防組小腸組織絨毛長度升高，(P均＜0.05)。

2.3 各組小鼠生存情況觀察 造模第15天時，對照組、照射組、預防組和治療組小鼠分別存活10、3、5、4只，與對照組比較，照射組、預防組和治療組小鼠存活只數(shù)少(P均＜0.05)，與照射組比較，預防組小鼠存活只數(shù)多(P均＜0.05)。

3 討論

放射性腸炎在古代中醫(yī)文獻中并無明確記載，但其臨床癥狀與古代中醫(yī)的腸游、泄瀉、痢疾十分相似［10]，2017年發(fā)布的《放射性直腸炎(腸澼)中醫(yī)診療專家共識》中提出放射性直腸炎中醫(yī)病名命名為“腸澼”，急性期以熱毒傷絡型多見，慢性期多見寒熱錯雜［11]。本研究中使用的灌腸液，處方功效為清熱、涼血、止血、止痛，用以緩解和治療患者由于放射線照射后腸道蘊熱、氣血壅滯、濕性黏滯引起的不同程度的腹痛，腹瀉、便血等癥狀。灌腸劑組方中黃芩、黃連、黃柏可清熱燥濕、瀉火解毒;白花蛇舌草利濕通淋;白頭翁、葛根、秦皮可涼血止痢、升陽止瀉、收斂止痢;蒲公英消腫散結;地榆涼血止血;敗醬草、烏藥、延胡索可活血、祛瘀、行氣、止痛。組方以收斂、解痙、消炎、保護腸黏膜、促進損傷修復和止血為主，定位于改善疾病及遠期療效(預防復發(fā))。

小腸絨毛上皮細胞，特別是隱窩干細胞，對放療的早期效應非常敏感［12]，雖然在劑量一定限度內，小腸可通過隱窩干細胞進行自我更新使得放射破壞的上皮細胞得到修復，但是上皮補償性增值更新不足導致炎癥和黏膜屏障受損，一般在放射治療2～3周時可出現(xiàn)腹痛、腹瀉等胃腸道相關癥狀［13]。腸道照射劑量和聯(lián)合同步化療等因素均影響患者發(fā)生放射性腸炎的風險，發(fā)生急性腸道毒性的患者發(fā)生慢性不良反應的也風險增加［14]。機械屏障是腸道屏障中最為重要的一部分，放射線可損傷腸道黏膜上皮細胞結構完整性，破壞腸道機械屏障，使得腸道組織結構和功能均發(fā)生變化。因此，提高上皮細胞增值、維持腸道黏膜完整對于放射性腸道損傷的預防和治療至關重要。有文獻［15]報道，與出現(xiàn)放射性直腸炎癥狀后用藥相比，在照射開始第一天即用中藥保留灌腸，可有效推遲放射性直腸炎癥狀出現(xiàn)時間，減輕放射性直腸炎的癥狀。

本研究中，預防組小鼠小腸隱窩細胞數(shù)、腸絨毛形態(tài)及絨毛長度均顯著高于照射組，證實該自擬放射性腸炎灌腸液可減輕或修復放射線對腸黏膜層破壞，對小鼠小腸黏膜上皮細胞具有保護和修復作用。而治療組與照射組無差異，可能由于經(jīng)照射后，小鼠腸道黏膜已經(jīng)破壞，灌腸機械操作可能加重對腸道的破壞作用。一項納入25篇中藥保留灌腸與西藥保留灌腸治療放射性直腸炎效果的隨機對照試驗的meta分析［16]結果顯示，與西藥(慶大霉素、甲硝唑、利多卡因、地塞米松等)灌腸相比，干預至少14天后，中藥灌腸組的臨床總有效率顯著提高，但干預10天后，2組療效無差異，作者分析原因可能為干預時間較短，尚未達到藥效發(fā)揮的時間有關。本研究結果中治療組對腸道防護效果不優(yōu)于照射組，可能也有用藥時間較短有關。受課題經(jīng)費等原因，本實驗僅進行了腸道機械屏障損傷的防護作用研究，后續(xù)還應從腸道微生物屏障、免疫屏障、化學屏障方面對灌腸液的放射損傷防護作用機制進行闡明。

綜上所述，自擬放射性腸炎灌腸液預灌腸的急性放射性腸炎小鼠腸道黏膜屏障損傷程度低，發(fā)生急性放射性腸炎的小鼠自擬放射性腸炎灌腸液灌腸后腸道黏膜屏障損傷程度減輕。自擬放射性腸炎灌腸液灌腸對急性放射性腸炎小鼠腸道黏膜屏障損傷有預防及治療作用。放射性直腸炎中醫(yī)治療包括中藥口服、灌腸，或口服灌腸并用，但以口服與灌腸并用效果最佳［17]，本研究結果采用的是單純灌腸，在后期臨床實踐中，可考慮聯(lián)合應用口服和灌腸液，但對于腸道機械屏障已經(jīng)嚴重破壞的患者，不建議灌腸，以免進一步破壞腸道黏膜，可能加重臨床癥狀。