電鏡技術(shù)在我國(guó)核桃屬植物研究中的應(yīng)用

王承建，舒秀閣，梁 靜，賈 明，劉丙花，王小芳，于艷萍，趙登超*

(1.山東省航空護(hù)林站，山東濟(jì)南250014;2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014；3.山東省日照市五蓮中學(xué)，山東日照262300)

電子顯微鏡，簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡，把人眼睛的分辯能力從0.2mm 拓展至亞原子量級(jí)，顯著增強(qiáng)了人類(lèi)觀察微觀世界的能力，被稱(chēng)之為人類(lèi)的“科學(xué)之眼”。 電子顯微鏡發(fā)明于20 世紀(jì)30年代，經(jīng)過(guò)了近百年的發(fā)展，電子顯微鏡先后應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)和材料學(xué)等學(xué)科和領(lǐng)域，并與各學(xué)科相互交叉，相互滲透，協(xié)作發(fā)展。 隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其與其他科學(xué)技術(shù)的相互協(xié)作也越來(lái)越廣泛，目前電鏡技術(shù)在植物學(xué)不同樹(shù)種上的應(yīng)用也是越來(lái)越深入，尤其在植物細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)和生理學(xué)等的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

核桃( Juglans regia L.)為世界四大堅(jiān)果之一，在亞洲、美洲和歐洲很多地區(qū)均有分布。 在我國(guó)作為重要的木本糧油樹(shù)種，從南到北在四川、山東、云南等21 個(gè)?。ㄊ?、區(qū)）均有大面積的核桃生產(chǎn)性栽培，因?yàn)槠溥m宜栽培范圍廣，在山地、丘陵或者平原地區(qū)均可進(jìn)行種植，被人們稱(chēng)之為‘鐵桿莊稼’。 核桃核仁營(yíng)養(yǎng)豐富、口感清香，富含生育酚等物質(zhì)，核桃殼產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益，作為我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展的木本油料樹(shù)種之一，尤其在我國(guó)農(nóng)村精準(zhǔn)扶貧、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和新農(nóng)村建設(shè)等方面發(fā)揮了十分重要的作用。 隨著核桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和相關(guān)基礎(chǔ)理論研究的深入，電鏡技術(shù)也越來(lái)越多地被科研工作者應(yīng)用在核桃樹(shù)種的研究中，為此筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了電鏡技術(shù)在我國(guó)核桃屬植物基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用和研究成果，同時(shí)根據(jù)當(dāng)前核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求和科學(xué)技術(shù)研究現(xiàn)狀，提出了電鏡技術(shù)在核桃屬植物的應(yīng)用研究方向和重點(diǎn)，以期為相關(guān)人員在核桃方面的科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 核桃屬植物孢粉學(xué)研究

研究表明，核桃花粉形態(tài)特征在遺傳上具有較強(qiáng)的保守性和穩(wěn)定性，不同種屬的核桃花粉形態(tài)特征在研究確定核桃屬植物種類(lèi)起源、進(jìn)化或分類(lèi)中具有十分重要的意義。 目前我國(guó)科研工作者利用掃描電鏡分別研究了核桃不同科屬、不同品種或者無(wú)性系花粉的形態(tài)特征。 毛霞等[1]研究發(fā)現(xiàn)胡桃科植物的花粉均為單?；ǚ?， 根據(jù)花粉大小的演化，認(rèn)為楓楊的演化程度最高，美國(guó)山核桃的演化程度最低，而美國(guó)黑核桃、普通核桃、華東野核桃、和青錢(qián)柳為中等演化水平；根據(jù)周孔類(lèi)花粉最進(jìn)化，3 孔花粉次之，3 孔溝花粉較原始的原則[2]，認(rèn)為美國(guó)山核桃花粉較核桃、青錢(qián)柳和楓楊原始；根據(jù)較原始植物花粉均具有光滑且無(wú)定型的外壁，花粉表面紋飾的演化趨勢(shì)為表面光滑→表面具小穴、 小溝狀雕紋→粗糙并具疣狀紋飾→表面顆粒狀→表面網(wǎng)狀分類(lèi)原則[3]，核桃屬植物花粉表面紋飾均為密集分布的顆粒狀并分布在整個(gè)花粉表面，而普通核桃為較為進(jìn)化的樹(shù)種。

劉壯壯等[4]和李川[5]等分別對(duì)美國(guó)薄殼山核桃和浙江山核桃無(wú)性系的花粉進(jìn)行了掃描電鏡觀察，結(jié)果表明美國(guó)薄殼山核桃品種‘威斯頓’（Western）、‘卡多’（Caddo）、‘薩波’（Sauber）、‘斯圖爾特’（Stuart）、‘馬罕’（Mahan）和浙江薄殼山核桃無(wú)性系花粉以單粒形式存在， 美國(guó)薄殼山核桃花粉具有3個(gè)萌發(fā)孔，且均勻的分布在赤道面上，赤道面觀呈現(xiàn)出橢圓形，極面觀因品種不同呈現(xiàn)近圓形或三角形，‘薩波’的花粉體積最大，‘威斯頓’的花粉體積最?。弧诡D’、‘薩波’、‘斯圖爾特’、‘馬罕’ 的花粉表面紋飾較相似，均呈瘤狀紋飾，‘卡多’和‘威斯頓’為較進(jìn)化的品種，‘薩波’則為較原始的品種；浙江山核桃無(wú)性系5 號(hào)和27 號(hào)極面觀呈近圓形，而無(wú)性系35 號(hào)極面觀呈近三角形； 三個(gè)無(wú)性系花粉粒形狀均為扁球形，花粉表面呈顆粒狀紋飾，均勻分布著顆粒狀的突起，表面紋飾差異不明顯。 寧萬(wàn)軍等[6]利用電鏡研究了新疆早實(shí)核桃不同品種花粉粒形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)‘新新2 號(hào)’核桃花粉粒性狀為扁球形，其余為近球形，花粉大小為中等型；花粉外壁存在多個(gè)孔，‘新溫905’的孔5 個(gè)，較少，‘新新2號(hào)’的孔13 個(gè)，最多。 對(duì)比發(fā)現(xiàn)早實(shí)核桃萌發(fā)孔較山核桃萌發(fā)孔小，‘溫185’ 核桃品種花粉形態(tài)較為勻稱(chēng)，為輻射對(duì)稱(chēng)型。

2 核桃花芽分化形態(tài)學(xué)研究

研究表明果樹(shù)花芽分化對(duì)果實(shí)的產(chǎn)量品質(zhì)均具有十分重要的影響，作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一，核桃樹(shù)體花芽的質(zhì)量、數(shù)量也決定了核桃產(chǎn)量、堅(jiān)果的品質(zhì)和質(zhì)量，進(jìn)而影響了核桃果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。 花芽分化的過(guò)程復(fù)雜，也是科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)，目前我國(guó)科研工作者已對(duì)核桃的花芽分化進(jìn)程，花芽分化的階段進(jìn)行了劃分，鄧烈和高英等[7-8]利用電鏡分別觀察了‘阿4 號(hào)’、‘遼寧1 號(hào)’核桃品種花芽分化進(jìn)程，人為的把其過(guò)程劃分為5 個(gè)時(shí)期，即成花誘導(dǎo)期、花柄分化期、苞片分化期、花被分化期和雌蕊分化期。 核桃花芽分化各個(gè)階段起始和持續(xù)時(shí)間不同, 主要與核桃栽培區(qū)域溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和品種不同而表現(xiàn)出顯著差異。 核桃雌、雄花發(fā)育形成時(shí)期不同，根據(jù)核桃雌花、雄花發(fā)育時(shí)間，可分為雌先型、雄先型。 雌先型核桃品種在花芽分化時(shí)間上要領(lǐng)先于雄先型品種，雌先型核桃品種在上個(gè)生長(zhǎng)季完成花被原基的分化，而雄先型核桃品種在生長(zhǎng)季當(dāng)季雌蕊原基中僅完成苞片原基的分化，雌先型品種在進(jìn)入休眠期之前比雄先型品種至少多分化一輪花器官原基，且與核桃不同品種的開(kāi)花和展葉的時(shí)期無(wú)關(guān)[9-10]。通過(guò)電鏡觀察確定核桃雄花芽的分化過(guò)程和不同類(lèi)型核桃品種花芽分化時(shí)間差異，對(duì)于調(diào)控核桃花芽質(zhì)量，調(diào)節(jié)花芽分化與坐果的關(guān)系，保證其果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的意義。

3 核桃良種嫁接愈合組織細(xì)胞學(xué)觀察

嫁接繁育良種是核桃優(yōu)良品種和新品種有效推廣的重要技術(shù)途徑和手段，當(dāng)前我國(guó)核桃良種繁育技術(shù)主要以芽接和枝接方法為主[11-12]，利用電鏡觀測(cè)嫁接愈合過(guò)程，對(duì)于了解和掌握核桃良種壯苗生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)生產(chǎn)高質(zhì)量核桃良種壯苗，實(shí)現(xiàn)核桃的優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)具有十分重要意義。 兗攀等[13]研究了美國(guó)山核桃‘馬罕’枝接‘波尼’后嫁接體組織愈合的細(xì)胞學(xué)特征，結(jié)果表明，嫁接體嫁接愈合過(guò)程經(jīng)歷可劃分為4 個(gè)時(shí)期， 愈合過(guò)程時(shí)間段為40d 左右，4 個(gè)時(shí)期分別為砧/穗隔離期、愈傷組織生長(zhǎng)期、形成層環(huán)構(gòu)成期和新生維管組織分化期，每個(gè)時(shí)期的時(shí)間間隔分別為5d ～15 d，嫁接后30d 左右為嫁接成活的關(guān)鍵期，愈傷組織的發(fā)生期與葉片展開(kāi)在同一時(shí)期，主要產(chǎn)生于形成層處；嫁接未成活的砧穗結(jié)合體中愈傷組織較少，并發(fā)生褐化現(xiàn)象，不同條件導(dǎo)致愈傷組織生長(zhǎng)受阻，可能是影響嫁接成活的重要內(nèi)在因素。 為此作者認(rèn)為實(shí)際的核桃嫁接（或者高接改優(yōu)）生產(chǎn)操作過(guò)程中，如何為嫁接體愈傷組織的產(chǎn)生、生長(zhǎng)和形成層環(huán)的構(gòu)成提供有力的條件保障， 是嫁接技術(shù)改進(jìn)的重要方向和目標(biāo)，是實(shí)現(xiàn)嫁接成活和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)良種壯苗的重要途徑和保證。

4 核桃枝葉、果皮和種子超微結(jié)構(gòu)觀察

利用電鏡研究核桃枝條和葉片組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)核桃枝葉顯微結(jié)構(gòu)與核桃的抗逆性（抗旱、抗寒、耐鹽堿等）具有顯著的相關(guān)性，孫志超[14]通過(guò)試驗(yàn)篩選出葉片海綿組織厚度、皮孔長(zhǎng)度、柵欄組織與海綿組織厚度比和皮層厚度及導(dǎo)管長(zhǎng)度5 個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)山核桃耐旱性能的技術(shù)指標(biāo)。 抗寒性差的核桃品種‘晉龍1 號(hào)’細(xì)胞葉綠體和質(zhì)膜損傷明顯，且在低溫條件下，超氧陰離子的濃度較高，葉片質(zhì)球較多，葉綠體中基粒片層變薄，葉片的細(xì)胞質(zhì)、線粒體及細(xì)胞核中Ca2+濃度始終處于較高水平， 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)冷害明顯，部分幼葉葉緣呈水浸狀；抗寒性強(qiáng)核桃品種‘哈特雷’葉片中超氧陰離子濃度低，葉綠體中脂質(zhì)球少，細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)完整，葉肉細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)短時(shí)間的Ca2+高峰，隨后恢復(fù)到靜息態(tài)水平，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化不大，葉片無(wú)明顯冷害癥狀；核桃細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的完整性與超氧陰離子積累之間可能存在一定的相互關(guān)系，低溫時(shí)葉綠體、線粒體可能起著臨時(shí)貯存Ca2+的作用， 以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度回落到靜息態(tài)水平[15-16]。 核桃氣孔存在不均勻關(guān)閉現(xiàn)象， 鹽脅迫下氣孔導(dǎo)度存在明顯抑制現(xiàn)象，核桃氣孔完全關(guān)閉是， 保衛(wèi)細(xì)胞中間有一條縫，核桃氣孔明顯的前后腔現(xiàn)象是氣孔的一個(gè)基本結(jié)構(gòu)，鑒于核桃氣孔結(jié)構(gòu)特征, 測(cè)量其氣孔開(kāi)度時(shí)要進(jìn)行正確的定位，同時(shí)為正確地區(qū)分氣孔的邊界與保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)側(cè)壁的外緣提供良好的植物樣本[17]。 核桃果實(shí)內(nèi)維管束系統(tǒng)在果實(shí)表面有開(kāi)放的端口，早實(shí)核桃與晚實(shí)核桃品種存在差異；內(nèi)果皮（果殼）無(wú)維管束聯(lián)系，核桃果皮分為外、中、內(nèi)3 層果皮組織結(jié)構(gòu)，外果皮有數(shù)層細(xì)胞組成，前期表皮細(xì)胞密布腺毛，后期發(fā)育出角質(zhì)層和氣孔構(gòu)造；中果皮為果肉大部分，細(xì)胞大，中間散生多維管束；內(nèi)果皮生長(zhǎng)前期與中果皮不明顯界限，果皮細(xì)胞小而透明，生長(zhǎng)后期內(nèi)果皮木質(zhì)化加速，進(jìn)一步形成硬殼并轉(zhuǎn)化為石細(xì)胞層，其外的維管束組織高度發(fā)達(dá)成網(wǎng)格狀[18]。核桃果實(shí)成熟后掃描電鏡觀察果實(shí)核桃表面存在裂紋并有孔洞，實(shí)現(xiàn)與外界氣體進(jìn)行交換，造成核桃種子不耐常溫貯存。 核桃枝葉抗逆性和果皮發(fā)育結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察結(jié)果，為下一步制定適宜的生產(chǎn)栽培管理措施，提高核桃生長(zhǎng)勢(shì)，提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)提供了有效的科學(xué)理論依據(jù)。

5 核桃木材及核桃殼加工性能

核桃渾身是寶，核桃木、核桃葉、核桃青皮和核桃殼等可加工為多種副產(chǎn)品，核桃木為優(yōu)質(zhì)的硬闊木樹(shù)種之一，被廣泛的用于軍工、家具制造或者雕刻材料等。 目前，我國(guó)科研學(xué)者利用掃描電鏡技術(shù)來(lái)研究不同樹(shù)種木材解剖、木材物理學(xué)和力學(xué)特征等方面的性質(zhì)，為樹(shù)種的遺傳改良、木材質(zhì)地性質(zhì)提升提供了有力的科學(xué)依據(jù)[19-20]， 早在20 世紀(jì)80年代，我國(guó)科研工作者首次利用電鏡對(duì)中國(guó)的裸子植物木材進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)研究。 80年代末，王代運(yùn)等[21]利用掃描電鏡對(duì)核桃楸木材導(dǎo)管分子及周?chē)?xì)胞的關(guān)系和各分子大小在量的變化做詳細(xì)的測(cè)定。核桃殼作為重要的復(fù)合原料和生物質(zhì)材料，因其資源再生性而被廣泛的應(yīng)用。 高留意等[22]用鈦酸酯偶聯(lián)劑改性核桃殼粉，與廢白土、低密度聚乙烯制備復(fù)合材料，同時(shí)利用掃描電鏡觀察核桃殼粉及復(fù)合材料表面微觀形態(tài)，核桃殼粉無(wú)纖維細(xì)胞，木質(zhì)素和半纖維含量較多，纖維含量較少，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著廢白土用量的增加，復(fù)合材料的力學(xué)性能、熔體指數(shù)呈先升后降趨勢(shì)。 常州大學(xué)利用電鏡和紅外光譜分析油浴和微波預(yù)處理后的山核桃殼，發(fā)現(xiàn)山核桃殼緊密的結(jié)構(gòu)遭到破壞， 變成更加易于酶解的松散、多孔結(jié)構(gòu)[23]。 核桃殼也可作為一種高效吸附材料，李榮華等[27]以核桃殼粉為吸附劑，研究了其對(duì)Cr（Ⅵ）的吸附熱力學(xué)特征，利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，吸附Cr（Ⅵ）后的核桃殼殘?jiān)砻孀兊霉饣⑶依饨亲兊妮^為模糊，作者認(rèn)為核桃殼對(duì)Cr（Ⅵ）的吸附不僅僅是一個(gè)單純的物理或者化學(xué)吸附過(guò)程，核桃殼表面的化學(xué)官能團(tuán)與Cr（Ⅵ）在強(qiáng)酸性的環(huán)境條件下發(fā)生了氧化還原反應(yīng)[24]認(rèn)為核桃殼粉是具有吸附污水中鉻的能力和潛在利用價(jià)值的生物質(zhì)吸附劑。 以上研究為核桃殼的綜合利用加工提供了有力的技術(shù)支持。

6 核桃病蟲(chóng)鑒別觀察

電鏡技術(shù)可有效提高人類(lèi)的分辨能力，尤其在昆蟲(chóng)微小器官辨別等方面發(fā)揮十分重要的作用，我國(guó)科研學(xué)者利用電鏡觀察了核桃舉肢蛾和透翅蛾的器官形態(tài)特征[25-26]，發(fā)現(xiàn)核桃舉肢蛾雌蛾性腺和雄蛾觸角表面進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)核桃舉肢蛾性信息素分泌腺位于腹尖末端8-9 節(jié)之間, 為一個(gè)由節(jié)間膜特化而成的完整上皮環(huán)結(jié)構(gòu), 性信息素感受器有毛形感器和刺形感器，核桃舉肢蛾雄蛾觸角毛形感器較多可以很好的感知雌蛾的性信息素。 山核桃透翅蛾幼蟲(chóng)頭部的形態(tài)特征、感器類(lèi)型、分布特點(diǎn)并對(duì)部分感受器的功能進(jìn)行了初步判斷，發(fā)現(xiàn)山核桃透翅蛾幼蟲(chóng)的頭為下口式， 頭部有觸角、單眼、上唇、下唇、上顎、下顎、吐絲器等。 觸角上有3種感器：其中柄節(jié)無(wú)感器；梗節(jié)具有3 個(gè)刺形感器，2 個(gè)錐形感器； 鞭節(jié)上有1 個(gè)栓錐形感器和1 個(gè)錐形感器。 口器有7 種感器：其中上唇表面具有12 個(gè)刺形感器和1 個(gè)叉形感器；上顎莖節(jié)具有1 對(duì)刺形感器，顎葉和下顎須基部周?chē)谐纱氐母杏X(jué)錐。 顎葉端部有1 個(gè)感器，分別為1 個(gè)栓錐形感器，1 個(gè)錐形感器，1 個(gè)錐乳頭狀感器。為核桃舉肢蛾性信息素快速提取、分析、合成提供依據(jù)，同時(shí)為探討核桃透翅蛾的各器官功能機(jī)制提供理論依據(jù)。

7 研究展望

近百年來(lái)隨著電子顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展迅速，電鏡技術(shù)在核桃屬植物的科學(xué)研究中也發(fā)揮了十分重要的作用，通過(guò)‘科學(xué)之眼’做到眼見(jiàn)為實(shí)，清晰的觀察其形態(tài)學(xué)變化，本文綜述了目前電鏡技術(shù)在我國(guó)核桃屬植物孢粉學(xué)、花芽分化、嫁接愈傷、枝葉抗逆顯微結(jié)構(gòu)、核桃殼加工性能和昆蟲(chóng)微小器官辨別方面的應(yīng)用，為核桃屬植物品種鑒別、進(jìn)化分類(lèi)、種苗繁育、資源抗逆性評(píng)價(jià)、副產(chǎn)品加工利用和蟲(chóng)害鑒別等方面的科學(xué)研究提供了強(qiáng)有力科技支撐， 有效的加強(qiáng)了我國(guó)核桃學(xué)科基礎(chǔ)理論知識(shí)，從而促進(jìn)了核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展。 認(rèn)識(shí)到電鏡技術(shù)在核桃學(xué)科發(fā)揮重要作用的同時(shí)，與電鏡技術(shù)在其他學(xué)科或者樹(shù)種上的應(yīng)用研究相比，電鏡技術(shù)在核桃屬植物方面研究還有待于進(jìn)一步應(yīng)用，尤其伴隨著新技術(shù)、新問(wèn)題的出現(xiàn)，作者認(rèn)為在核桃芽接體愈傷組織形成、核桃病原菌辨別與分類(lèi)和高檔木材材質(zhì)分析等方面還有待于進(jìn)一步深入研究。 與美國(guó)、日本等發(fā)現(xiàn)國(guó)家相比，我國(guó)的電鏡技術(shù)和設(shè)備還相對(duì)弱后，可引進(jìn)國(guó)外應(yīng)用的激光焦距掃描顯微鏡、掃描激光聲音顯微鏡、 直接圖像顯微鏡等儀器設(shè)備，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其功能，提供儀器設(shè)備實(shí)用效率，合理高效利用現(xiàn)有資源和設(shè)備。 隨著今后多學(xué)科多技術(shù)的交叉與協(xié)同應(yīng)用， 尤其是現(xiàn)代計(jì)算技術(shù)的融合發(fā)展，將使電鏡技術(shù)不斷地完善和提升，同時(shí)隨著電鏡樣品制備技術(shù)提升，將使電鏡技術(shù)在核桃屬植物的科學(xué)研究方面發(fā)揮更重要的作用，為核桃產(chǎn)業(yè)和學(xué)科的發(fā)展提供更有利的科技支持。