生物安全對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)非洲豬瘟病毒的重要性

張雪梅 祁俊娟 王丹怡 王艷紅 詹穎潔 唐艷榮

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

自2018年8月3日，經(jīng)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷并確診沈陽市沈北新區(qū)沈北街道（新城子）發(fā)生我國第一例非洲豬瘟疫情。至2019年3月22日全國共有28個(gè)省發(fā)生疫情，非洲豬瘟疫情已經(jīng)波及到多家上市公司，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，也對(duì)生豬產(chǎn)品質(zhì)量安全和有效供給構(gòu)成威脅。中國非洲豬瘟疫情防控形勢(shì)已十分嚴(yán)峻。

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種獨(dú)特的雙鏈DNA病毒，它是目前唯一的DNA蟲媒病毒。非洲豬瘟不是人畜共患病，不會(huì)感染人，同時(shí)它也不會(huì)感染豬之外的其他動(dòng)物，不影響食品安全。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。主要癥狀：自然感染潛伏期很短，發(fā)病時(shí)體溫升高至41℃，約持續(xù)4d，直到死前48h，體溫開始下降，同時(shí)臨床癥狀才顯示出來，豬只食欲減退，顯出極度需弱，呼吸困難，漿液或粘液結(jié)膜炎，有時(shí)會(huì)引起帶血性下痢，嘔吐，死亡。

主要病理變化：在耳、鼻、腋下、鹛腹、會(huì)陰、尾、腳無毛部分呈界線明顯的紫色斑。在淋巴節(jié)有豬瘟罕見的某種程度之出血現(xiàn)象；脾臟腫大，有些腫大可至10倍，質(zhì)脆；循環(huán)系統(tǒng)：心包液特別多，多數(shù)呈現(xiàn)心包下及次心內(nèi)膜充血；呼吸系統(tǒng)：喉、會(huì)厭有瘀斑充血及擴(kuò)散性出血，鏡檢常有充血而沒有出血病灶，肺泡則呈現(xiàn)出血現(xiàn)象，淋巴球呈破裂。

我國的非洲豬瘟疫情由國外傳入。國內(nèi)疫情傳播主要通過生豬及其產(chǎn)品跨區(qū)域調(diào)運(yùn)、餐廚剩余物喂豬、人員與車輛帶毒傳播這三種途徑。由于在世界范圍內(nèi)到目前為止沒有研發(fā)出可以有效預(yù)防非洲豬瘟的疫苗，豬一旦感染死亡率為100%，給我國疫病防控帶來非常大的安全隱患。所以及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情變得尤為重要。由于非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟癥狀相似，只能依靠實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)確診。

目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)非洲豬瘟的方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。我實(shí)驗(yàn)室主要采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)非洲豬瘟進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR是最廣泛應(yīng)用的病毒學(xué)診斷技術(shù)，敏感度高、特異性強(qiáng)、能夠?qū)崿F(xiàn)ASFV核酸的快速檢測(cè)。此法容易發(fā)生交叉污染，應(yīng)該采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施來減少和控制污染風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。

非洲豬瘟病毒對(duì)溫度和pH的抵抗力較強(qiáng)，在低溫暗室內(nèi)存在血液中之病毒可生存六年，室溫中可活數(shù)周，加熱被病毒感染的血液55℃30分鐘或60℃10分鐘病毒將被破壞，許多脂溶劑和消毒劑可以將其破壞。

針對(duì)ASFV特點(diǎn)及PCR診斷技術(shù)的特點(diǎn)，做好實(shí)驗(yàn)室生物安全尤為重要。下面從幾方面談一下實(shí)驗(yàn)室生物安全。

第一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，PCR實(shí)驗(yàn)要求在生物安全二級(jí)（BSLII）及以上實(shí)驗(yàn)室來完成。實(shí)驗(yàn)室選址、設(shè)計(jì)和建造應(yīng)符合國家和地方環(huán)境保護(hù)和建設(shè)主管部門等的規(guī)定和要求。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部必須分區(qū)，避免交叉污染，實(shí)驗(yàn)室的走廊和通道應(yīng)不妨礙人員和物品通過。

第二、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)應(yīng)保證對(duì)生物、化學(xué)、輻射和物理等危險(xiǎn)源的防護(hù)水平控制在經(jīng)過評(píng)估的可接受程度，防止危害環(huán)境。實(shí)驗(yàn)室的建筑材料和設(shè)備等應(yīng)符合國家相關(guān)部門對(duì)該類產(chǎn)品生產(chǎn)、銷售和使用的規(guī)定和要求。

第三、應(yīng)有專門設(shè)計(jì)以確保存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)運(yùn)、收集、處理和處置危險(xiǎn)物料的安全。應(yīng)清楚地標(biāo)示出具體的危險(xiǎn)材料、危險(xiǎn)，包括：生物危險(xiǎn)、有毒有害、腐蝕性、輻射、刺傷、電擊、易燃、易爆、高溫、低溫、強(qiáng)光、振動(dòng)、噪聲、動(dòng)物咬傷、砸傷等；需要時(shí)，應(yīng)同時(shí)提示必要的防護(hù)措施。

（1）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)標(biāo)示危險(xiǎn)區(qū)、警示區(qū)，包括用于特殊情況下的臨時(shí)標(biāo)識(shí)，如“污染”、“消毒中”、“設(shè)備檢修”等。在某些情況下，宜同時(shí)使用標(biāo)識(shí)和物理屏障標(biāo)示出危險(xiǎn)區(qū)。

（2）標(biāo)識(shí)應(yīng)明確、醒目和易區(qū)分。只要可行，應(yīng)使用國際、國家規(guī)定的通用標(biāo)識(shí)。

（3）實(shí)驗(yàn)室入口處應(yīng)有標(biāo)識(shí)，明確說明生物防護(hù)級(jí)別、操作的致病性生物因子、實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人姓名、緊急聯(lián)絡(luò)方式和國際通用的生物危險(xiǎn)符號(hào)；實(shí)驗(yàn)室所有房間的出口和緊急撤離路線應(yīng)有在無照明的情況下也可清楚識(shí)別的標(biāo)識(shí)；所有管道和線路應(yīng)有明確、醒目和易區(qū)分的標(biāo)識(shí)；在須驗(yàn)證或校準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的明顯位置注明設(shè)備的可用狀態(tài)、驗(yàn)證周期、下次驗(yàn)證或校準(zhǔn)的時(shí)間等信息。

（4）所有操作開關(guān)應(yīng)有明確的功能指示標(biāo)識(shí)，必要時(shí)，還應(yīng)采取防止誤操作或惡意操作的措施。

實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理

第一、建立質(zhì)量與生物安全管理體系：設(shè)立生物安全委員會(huì)，要建立生物安全監(jiān)督員和內(nèi)審員隊(duì)伍，定期進(jìn)行生物安全督促檢查；要求各部門執(zhí)行本單位編制的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量與生物安全管理體系文件，并按文件規(guī)定的程序開展各項(xiàng)管理活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室管理層應(yīng)負(fù)責(zé)安全管理體系的設(shè)計(jì)、實(shí)施、維持和改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)室安全管理體系應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模、實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)的復(fù)雜程度和風(fēng)險(xiǎn)相適應(yīng)。

第二、人員管理：實(shí)驗(yàn)室生物安全工作的關(guān)鍵是人，人員要緊繃生物安全這根弦，保證所有實(shí)驗(yàn)人員持證上崗，所有實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)常進(jìn)行專業(yè)和管理培訓(xùn)，以達(dá)到增強(qiáng)生物安全防范意識(shí)的目的。工作中必須做好人員防護(hù)。抓好實(shí)驗(yàn)室生物安全人才隊(duì)伍建設(shè)。

第三、菌（毒）種和陽性樣本的管理：嚴(yán)格按照國家相關(guān)規(guī)定由熟悉相關(guān)的生物安全知識(shí)的人員實(shí)行雙人雙鎖管理制度。

第四、環(huán)境與設(shè)備管理：按《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全實(shí)行分級(jí)管理。制定相應(yīng)的操作規(guī)程并合理使用。重點(diǎn)提到是生物安全柜、無菌操作臺(tái)、高壓滅菌器的科學(xué)使用，銳器的使用和存放也應(yīng)合乎要求，消防器具不但在品種上要滿足實(shí)驗(yàn)室的特殊要求，而且要在保質(zhì)期內(nèi)使用。

第五、廢棄物安全管理是防止生物安全事件的重要一環(huán)。病原微生物實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物、儲(chǔ)存物、垃圾以及其他廢棄物的處理和處置必須以安全為目的，要制定消毒制度，儲(chǔ)備消毒劑，而且要確保消毒劑的有效性并對(duì)消毒效果進(jìn)行判定。

第六、檢測(cè)不同的實(shí)驗(yàn)要按不同的等級(jí)做好個(gè)人防護(hù)，建立應(yīng)急預(yù)案。

第七、實(shí)驗(yàn)室一天內(nèi)必做事情：早起第一件事就是給實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)；開啟實(shí)驗(yàn)室必備的儀器；檢查實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生情況，及時(shí)處理垃圾，保持干凈整潔；檢查實(shí)驗(yàn)室各種儀器的安全，尤其是電源插口處，是否有松動(dòng)，及時(shí)插緊；實(shí)驗(yàn)室的危險(xiǎn)儀器的使用，必須做到儀器在人在，以防出現(xiàn)事故及時(shí)處理；晚上離開實(shí)驗(yàn)室，切斷一些儀器的電源，并關(guān)好門窗，帶走廢棄物。

病原微生物實(shí)驗(yàn)室的安全性取決于實(shí)驗(yàn)人員的安全意識(shí)，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的建設(shè)，防護(hù)設(shè)備的配置和管理體系的完善，才能保證生物安全。只有在保證生物安全的基礎(chǔ)上，對(duì)非洲豬瘟病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確保真實(shí)有效，對(duì)非洲豬瘟疫情才能做到及時(shí)發(fā)現(xiàn)，提早控制，防止疫情的進(jìn)一步擴(kuò)散。