鐵皮石斛組培苗規(guī)范化生產標準操作規(guī)程(SOP)＊

韋榮昌，閆志剛，施力軍，吳慶華，黃芩芬，農定霖，覃 芳＊＊

（1. 廣西農業(yè)科學院 經濟作物研究所 南寧 530007；2. 廣西藥用植物園 南寧 530023；3. 廣西西林縣科技發(fā)展中心 西林 532500）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬多年生附生型草本植物，因其莖節(jié)處呈黑褐色，故又名黑節(jié)草[1]，主要以莖入藥，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材[2]，也是廣西著名道地藥材[3]，始載于《神農本草經》，列為上品，有“救命仙草”、“植物黃金”之美譽。鐵皮石斛性微寒，味甘，歸腎、胃經，主要活性成分為多糖和甘露糖，具有清熱滋陰、生津益胃的功效，廣泛應用于臨床、中藥復方和保健品中，主治煩渴口干、津傷熱病、胃陰不足、火旺陰虛、干嘔食少、目暗不明、骨蒸勞熱、筋骨痿軟、病后虛熱不退等癥[4]。

鐵皮石斛主要產地為廣西、云南、浙江、四川、福建和安徽等區(qū)域，多生于海拔1600m 的樹干或巖石上[5]，然而，由于種子產量極低（每個蒴果約有2-3 萬粒），且缺乏胚乳，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，因而自然萌發(fā)率較低，不足5%[6]，加之生境破壞和過度采挖，野生資源日漸枯竭，已被列入國家第一批《中國珍稀瀕危保護植物名錄》[7]。鑒于此，利用組織培養(yǎng)進行鐵皮石斛的種苗繁育，既可保護自然資源，又能滿足生產需求。為了進一步規(guī)范鐵皮石斛組培苗的生產流程，以提高其質量，筆者遵循《中藥材生產質量管理規(guī)范》（GAP）的指導，在深入產區(qū)調研的基礎上，對各個生產環(huán)節(jié)進行試驗驗證，最終制定出鐵皮石斛組培苗規(guī)范化生產標準操作規(guī)程。

1 范圍

本規(guī)程規(guī)定了鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)組培苗規(guī)范化生產的物種選擇、種質特征、生態(tài)習性、組織培養(yǎng)、瓶內煉苗、移栽煉苗、出圃、裝框、運輸和檔案記錄。

本規(guī)程適用于廣西壯族自治區(qū)境內鐵皮石斛組培苗的規(guī)范化生產。

2 引用標準

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

①GB 3095 環(huán)境空氣質量標準；GB 5084 農田灌溉水質標準；

②NY/T 394綠色食品肥料使用準則；

③GB 4285農藥安全使用標準；

④GB/T 8321（所有部分）農藥合理使用準則。

3 物種選擇

蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）。

4 種質特征

多年生附生草本。莖圓柱形，不分枝，具多節(jié)。葉基部下延為抱莖的鞘?？偁罨ㄐ蚓?-3 朵花，生于落了葉的莖上?；ㄐ蜉S回折狀彎曲；花苞片小，膜質，淺白色。萼片和花瓣黃綠色；唇瓣白色，長圓狀披針形，不明顯3裂，基部兩側具紫紅色條紋。唇盤密布短毛，中裂片白色并且具有1 個橫生的深紫色斑塊。花期3-6月[8]。

5 生態(tài)習性

主要分布在亞熱帶地區(qū)，分布中心位于北緯30°與北回歸線之間，海拔100-3000 m，以800-1500 m為佳，性喜溫涼、濕潤、多霧、通風、透氣、透水、晝夜溫差大、夜間濕度高的環(huán)境，自然透光度要求在20-50%，光照一般為漫射光、散射光，光照強度為1500-2000 lux，光強過強或過弱均會影響鐵皮石斛的產量和品質。其中，溫度為最主要的限制因子，25℃左右為最適生長溫度，通常超過35℃即停止生長，而溫度過低則會導致植株的凍傷或凍死。鐵皮石斛喜濕而又怕水漬，最適空氣濕度為60-80%，根部周圍含水量宜在50%左右，水分過多會導致爛根[9-11]。

6 組織培養(yǎng)

6.1 外植體的選擇與消毒

當果皮由綠色轉呈淡黃色時，選擇飽滿未分裂的蒴果作為外植體，用質量分數為2%的洗潔精水溶液浸泡5-10 min，再經線狀流水沖洗15-30 min；移至超凈工作臺上，用添加了2-3 滴吐溫-20 的質量分數為0.1%的升汞消毒8-10 min，然后用無菌水沖洗3-5 次（每次≥10 min），再用消毒濾紙或吸水紙除去表面水分，得到無菌外植體[12]。

6.2 無菌試管苗的制備

在超凈工作臺上，用解剖刀將經消毒的蒴果縱向切開，再用鑷子夾緊蒴果的一端輕輕抖動，將種子均勻地散布于種子萌發(fā)誘導培養(yǎng)基（1/2MS+0.3mg?L-1NAA+4.5 g?L-1瓊脂+30 g?L-1蔗糖+20%馬 鈴薯泥，pH 值為5.8）上，在培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照強度為1500-2000 lux，光照時間為每天12h的條件下連續(xù)培養(yǎng)30天，誘導種子萌發(fā)，獲得無菌試管苗。

6.3 原球莖增殖與分化

將種子萌發(fā)獲得的原球莖接種于增殖與分化培養(yǎng)基（1/2MS+1.0 mg?L-16-BA+0.1 mg?L-1NAA+4.5 g?L-1瓊脂+30 g?L-1蔗糖+2%活性炭，pH 值為5.8）中，在培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照強度為1500-2000 lux，光照時間為每天12h 的條件下連續(xù)培養(yǎng)45 天，誘導原球莖增殖與分化[13]。

6.4 試管苗生根培養(yǎng)

將經增殖與分化的試管苗接種于生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.5 mg?L-1NAA+4.5 g?L-1瓊脂+15 g?L-1蔗糖+15%香蕉泥，pH 值為5.8）中，在培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照強度為1500-2000 lux，光照時間為每天12h的條件下連續(xù)培養(yǎng)30-45天，誘導試管苗生根。

7 瓶內煉苗

獲得帶根的完整植株后，將瓶苗置于自然環(huán)境中適應2-3 周，逐漸增加光照強度。然后將瓶苗轉至室溫為25℃的室內，打開瓶蓋，在瓶中加入少量自來水，煉苗2-4天，待表面角質形成后將苗取出，用自來水洗凈根部培養(yǎng)基，待移栽。

8 移栽煉苗

8.1 搭棚建畦

選擇地勢高、遠離污染、背風向陽、排灌良好、交通便利、易于管理的地塊，搭建溫室大棚（空氣應符合GB 3095 環(huán)境空氣質量標準；灌溉水應符合GB 5084農田灌溉水質標準）。覆蓋材料選用透光性強、保溫性好的陽光板或塑料薄膜。棚內配備遮陽網、防蟲網，以及噴淋、控溫和調濕設備。

搭建寬100-140 cm 的畦，畦底離地架空50-70 cm。畦面用竹片、木板或塑料平網等作為基質的支撐面，畦上方50-100 cm處安裝定時霧化噴嘴[14]。

搭棚建畦準備就緒，再密閉大棚，用熏蒸劑消毒處理后方可投入使用。

8.2 苗床準備

選擇疏松透氣、保濕透水、不易發(fā)霉、無病菌和害蟲潛藏的水苔、刨花、椰絲、菌糠、木糠等作基質。先用蒸煮、日曬、堆漚和浸泡等方法進行基質消毒，然后調整基質含水量至50-60%。將基質鋪于畦面上，攤平，整成厚8-10 cm 的煉苗床。移栽前，以多菌靈1000倍液或0.3%高錳酸鉀噴灑基質。

8.3 移栽

當日平均氣溫為15-30℃時，即可出瓶移栽。株行距為4 cm×5 cm或5 cm×5 cm，在基質上挖2-3 cm深的孔洞，將鐵皮石斛幼苗根部小心放入洞中，然后用基質覆蓋，稍壓實，淋足定根水[15]。

8.4 苗期管理

8.4.1 補苗

移栽后15天，全面檢查，若發(fā)現死亡缺株，及時拔除并補以適齡小苗。

8.4.2 水分管理

保持基質含水量為50-60%，空氣相對濕度為70-80%。如遇高溫干旱，可于早晚噴霧降溫；多雨季節(jié)應及時清溝排水，降低濕度。

8.4.3 光照管理

采用遮陽網降低光照，前期遮光率為70-80%，后期遮光率為60-70%。

8.4.4 溫度管理

保持大棚內白天氣溫25-30℃，夜間15-20℃。高溫季節(jié)，及時通風散熱，噴霧降溫；低溫時節(jié)，密封大棚，必要時覆膜保溫，以免小苗凍傷。

8.4.5 追肥除草

遵守NY/T 394綠色食品肥料使用準則。移栽后7天，葉面噴施1/4MS 營養(yǎng)液，連噴4 次。此后，每15 天用磷酸二氫鉀葉面追肥1 次，并用腐熟有機肥撒施根部。根據雜草生長情況，及時除去畦面雜草，并對外露的根部進行覆蓋。

8.5 病蟲害防治

主要病害有黑斑、炭疽、白絹等病，主要害蟲有斜紋夜蛾、短額負蝗、軟體動物等。遵循“預防為主，綜合防治”的植保方針，優(yōu)先采用農業(yè)防治、物理防治、生物防治，合理使用高效低毒低殘留化學農藥（應符合GB 4285 農藥安全使用標準和GB/T 8321（所有部分）農藥合理使用準則），將有害生物造成的損失控制在經濟允許閾值內。

8.5.1 黑斑病

3-5 月，為害嫩葉，出現黑褐色斑點，斑點四周呈黃色，嚴重時枯萎脫落?？捎?∶1∶150的波爾多液，或10%的多菌靈1000 倍液，或10%世高水分散粒劑800倍液～1000倍液噴霧，連用2-3次。

8.5.2 炭疽病

1-5 月，為害葉片，呈現黑褐色病斑，嚴重時葉片脫落?？捎?0%施保功可濕性粉劑2000 倍液，或65%代森鋅600 倍液，或80%炭疽福美可濕性粉劑800倍液，每隔7-10天噴霧1次，連用2-3次。

8.5.3 白娟病

基部先腐爛，逐漸擴至莖、葉。一旦發(fā)現病株，立即拔除燒毀，并用生石灰粉處理病穴，或50%福多寧可濕性粉劑3000 倍液，或75%滅普寧可濕性粉劑1000倍液噴霧，每隔7天噴1次，連用2-3次。

8.5.4 斜紋夜蛾

7-10 月，為害嫩芽和嫩葉。以性誘劑、殺蟲燈等誘殺；清除初孵幼蟲群集的“紗窗葉”或卵塊；幼蟲低齡期，用5%抑太保乳油1500 倍液，或10%除盡乳油1500 倍液，或20%殺螨乳油1000-1500 倍液等噴霧，每隔7天噴1次，連用1-2次。

8.5.5 短額負蝗

取食葉片，嚴重時啃光整葉?？捎?0%辛硫磷乳油1000-1500倍液噴殺。

8.5.6 軟體動物

蠐螬、蝸牛、蛞蝓和某些螺類，為害嫩葉和幼莖，通常白天潛伏陰處，夜間爬出取食，雨天為害更重?？捎们嗖莼虿巳~獨餌誘殺，即用50kg 鮮草加50%辛硫磷乳油0.5kg，拌濕，于傍晚撒在畦間誘殺；或在畦四周撒施生石灰，防止其爬入畦內為害。

9 出圃

當苗高5-8cm，根長4-6cm，根數3-5 條，肉質莖具3-4節(jié)間，真葉4-5片時，即可出圃。

10 裝框

將小苗及其根部基質，慢慢挖起，整齊裝入無毒、無污染的竹筐或塑料筐內，并在框外貼附種苗標簽，標注種苗名稱，質量指標，種苗經營許可證編號，檢疫證明編號，生產日期，生產單位名稱及地址等。

11 運輸

運輸前做好植物檢疫，向外調運應附有病蟲害檢疫合格證書，手續(xù)隨車同行；將苗有序疊放，不能過度擠壓、隨意堆疊；長途運輸應有防風、防曬、防雨措施，盡量在夜間進行，避免高溫燒苗。

12 檔案記錄

詳細記錄組織培養(yǎng)、瓶內煉苗、移栽煉苗、出圃、裝框、運輸和檔案生產技術、病蟲害防治等各環(huán)節(jié)所采取的措施，并建立生產檔案。