致病菌金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌代謝產(chǎn)物及菌體成分對(duì)人呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響

張 鑫，秦嘯峰，黃 瓊，楊義然，杜曉楠，李 琴，呂 喆，陳 彥，王 煒，孫 英

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)與肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia,S.pneumonia)為呼吸道常見(jiàn)定植菌和條件致病菌。當(dāng)機(jī)體免疫功能出現(xiàn)異常時(shí)，兩種細(xì)菌的多種致病成分可突破機(jī)體免疫防御第一道防線進(jìn)而誘發(fā)多種呼吸道常見(jiàn)疾病，如慢性鼻-鼻竇炎、肺炎等疾病的發(fā)生[1-4]。

上皮細(xì)胞是發(fā)揮機(jī)體黏膜免疫防御功能的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞，其中肺泡上皮細(xì)胞是細(xì)菌等病原微生物感染肺部時(shí)最主要的靶細(xì)胞，其在接受細(xì)菌不同成分刺激后表現(xiàn)出不同程度的損傷及損傷后效應(yīng)，包括緊密連接的破壞、炎癥因子分泌的增加、趨化因子、抗菌肽的釋放等[5]，進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在肺部病原微生物的清除中發(fā)揮重要作用。

本研究以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)為研究對(duì)象，探討S.aureus與S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、細(xì)菌來(lái)源:人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)， 金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)于美國(guó)ATCC官網(wǎng)，2種菌株編號(hào)分別為ATCC29213、ATCC49619。

1.1.2 金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌細(xì)菌培養(yǎng)上清、細(xì)菌裂解物及滅活菌體的制備:于生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室將金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株按照要求進(jìn)行復(fù)蘇，鑒定后挑取單個(gè)典型菌落于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～16 h(肺炎鏈球菌需培養(yǎng)24～36 h)，隨后按照1∶100～1∶200的體積比將兩種細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接至500 ml新鮮培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。金黃色葡萄球菌經(jīng)14～16 h，肺炎鏈球菌經(jīng)24～36 h的培養(yǎng)后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)平板接種法計(jì)算菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。利用空白細(xì)菌培養(yǎng)基將兩種細(xì)菌的CFU調(diào)至相同數(shù)量(1×109CFU/ml)后12 000 rpm離心20 min收集兩種細(xì)菌的培養(yǎng)上清；一部分細(xì)菌沉淀經(jīng)0.1%甲醛重懸，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行滅活處理，去甲醛殘液后離心獲得細(xì)菌滅活菌體；另一部分菌體沉淀采用含蛋白酶抑制劑的PBS溶液重懸，采用超聲破碎的方法獲得兩種細(xì)菌裂解物并經(jīng)過(guò)BCA方法對(duì)其中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑:CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京四正柏生物科技有限公司；人源IL-6、IL-8 ELISA試劑盒、Claudin1兔多克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司；ZO-1兔多克隆抗體，Occludin鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；山羊抗小鼠熒光二抗(488-)、山羊抗兔熒光二抗(594-)、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2.2 儀器:全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)儀購(gòu)于PerkinElmer公司；流式細(xì)胞儀BD LSRFortessaTM購(gòu)于BD Biosciences公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀購(gòu)于Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī) 購(gòu)自Beckman Coulter公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與刺激：A549細(xì)胞參照說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，置于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率約80%時(shí)使用0.25%胰酶進(jìn)行細(xì)胞的消化及傳代接種操作。

將細(xì)胞分別接種至12孔、24孔、96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)60%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h后，細(xì)胞融合率達(dá)80%, 更換含兩種細(xì)菌不同成分的完全培養(yǎng)基對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察不同刺激物對(duì)其炎癥細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞凋亡與壞死、細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)一共分為7個(gè)組別：S.aureus/S.pneumonia培養(yǎng)上清刺激組(刺激用細(xì)菌培養(yǎng)上清量：DMEM培養(yǎng)基1∶5)、兩種細(xì)菌裂解物刺激組(裂解物刺激濃度：20 μg/ml)、兩種細(xì)菌滅活菌體刺激組(菌體刺激量：1×107CFU/ml)以及陰性對(duì)照組(無(wú)額外刺激物)。

1.3.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：各組細(xì)胞按照1.3.1方法于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK8檢測(cè)液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h后，于全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)檢測(cè)儀中測(cè)定各反應(yīng)孔在450 nm處的吸光度。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死：各組細(xì)胞按照1.3.1方法于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后，使用0.25%的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，利用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC和PI混合后，室溫避光孵育15 min，于流式細(xì)胞儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的比例。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞IL-6、IL-8分泌水平：收集上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8含量的變化。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照人IL-6/IL-8 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。加入辣根過(guò)氧化物酶的反應(yīng)底物至各反應(yīng)孔后，避光孵育10～15 min，加入50 μl終止液，將反應(yīng)板置于全波長(zhǎng)光吸收酶標(biāo)檢測(cè)儀中檢測(cè)各反應(yīng)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度并根據(jù)試劑盒所提供的的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6/IL-8的含量進(jìn)行定量分析。

1.3.5 Western Blot方法檢測(cè)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1，Claudin1，Occludin蛋白表達(dá)水平：各組細(xì)胞按照1.3.1方法于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行刺激培養(yǎng)24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次, 每孔加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液于冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，時(shí)間約30 min。收集裂解細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP管進(jìn)行超聲破碎處理。4 ℃離心，將含蛋白的上清液轉(zhuǎn)移至一新EP管中, 利用BCA方法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，并將蛋白樣品于- 80℃冰箱中分裝保存。

將各實(shí)驗(yàn)組蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液混合后于100 ℃條件下煮10 min對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理，加至10% SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi)進(jìn)行電泳分離(濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件：電流150 mA，時(shí)間 90 min)并用含3% BSA的TBST(含5% Tween-20的TBS緩沖液)室溫封閉1 h，PVDF膜在含ZO-1(按1∶500稀釋), Claudin1(按1∶200稀釋)、Occludin(按1∶200稀釋)和GAPDH(按1∶10 000稀釋)的抗體反應(yīng)液中4 ℃孵育過(guò)夜，次日經(jīng)TBST洗滌3次后，于室溫條件下與相應(yīng)種屬來(lái)源的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(按1∶10 000稀釋)反應(yīng)1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液于成像儀中進(jìn)行顯影。利用Image J對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行定量分析(內(nèi)參為GAPDH)。

1.3.6 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1，Claudin1，Occludin的表達(dá)：于細(xì)胞接種前，將預(yù)處理的細(xì)胞爬片置于24孔培養(yǎng)板中，按照1.3.1中的細(xì)胞培養(yǎng)及刺激條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。完成刺激24 h后棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞爬片2次，4%多聚甲醛(PFA)處理10 min以完成對(duì)玻片上細(xì)胞的固定。PBS洗去多余PFA，將爬片置于含1% BSA的PBST(含0.3%Trition X-100的PBS緩沖液)封閉液中室溫封閉1 h后，將細(xì)胞爬片置于含ZO-1(按1∶200稀釋), Claudin1(按1∶200稀釋)、Occludin(按1∶200稀釋)的抗體反應(yīng)液中4 ℃孵育過(guò)夜，次日經(jīng)PBST洗滌后的細(xì)胞與相應(yīng)種屬來(lái)源的熒光標(biāo)記IgG二抗(488-山羊抗小鼠熒光二抗1∶600，594-山羊抗兔熒光二抗1∶200)室溫反應(yīng)1 h，PBST洗去殘余二抗后加入含DAPI的封片劑進(jìn)行封片，一周內(nèi)于激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal)下進(jìn)行觀察和圖像的拍攝。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

與陰性對(duì)照組相比：不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清可顯著抑制A549細(xì)胞增殖，兩種細(xì)菌其他成分僅S.pneumonia裂解物對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)出增殖抑制作用(圖1)。

2.2 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響

與陰性對(duì)照組相比：S.aureus及S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清均可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及壞死現(xiàn)象，而兩種細(xì)菌其他成分僅S.pneumonia裂解物可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死現(xiàn)象，該部分結(jié)果與兩種細(xì)菌各成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用相一致(圖2)。

2.3 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子功能的影響

與陰性對(duì)照組相比：S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清均可促進(jìn)A549細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8，以S.pneumonia尤為顯著，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(圖3A、B)；兩種細(xì)菌裂解物刺激A549細(xì)胞可增加其IL-6的分泌水平，S.pneumonia裂解物亦可增加IL-8的分泌，其余細(xì)菌成分的刺激對(duì)于這2種炎癥細(xì)胞因子的分泌功能未表現(xiàn)出明顯影響(圖3C、D)。

2.4 S. aureus/S. pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組相比：A549細(xì)胞在經(jīng)過(guò)S.aureus滅活菌體刺激后，緊密連接蛋白ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，另兩種緊密連接相關(guān)蛋白Occludin，Claudin1蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，其余細(xì)菌成分刺激均未明顯表現(xiàn)出對(duì)A549細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響(圖4A、B)。利用細(xì)胞免疫熒光染色方法對(duì)上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行觀察，盡管目前尚無(wú)適用于此條件下緊密連接蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)，圖像中所示不同刺激物對(duì)于3種緊密連接蛋白表達(dá)的影響趨勢(shì)與前述一致(圖4C～E)。

3 討論

細(xì)菌感染在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中S.aureus、S.pneumonia所致的肺炎、慢性鼻-鼻竇炎等呼吸系統(tǒng)疾病在各地區(qū)廣泛流行，給家庭和社會(huì)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6-7]。治療過(guò)程中抗菌藥物的濫用引發(fā)耐藥菌株的出現(xiàn)進(jìn)一步加大了治療難度[8]，因而明確細(xì)菌感染過(guò)程中主要的致病成分，進(jìn)而針對(duì)其發(fā)揮作用的主要環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)和針對(duì)性的治療成為臨床上亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

細(xì)菌自身的代謝在維持細(xì)菌存活、毒力與致病作用的發(fā)揮方面至關(guān)重要，但目前對(duì)于細(xì)菌感染機(jī)體后其確切的代謝途徑、代謝產(chǎn)物及其作用的研究并不明確[9]。本研究利用S.aureus、S.pneumonia兩種細(xì)菌培養(yǎng)上清模擬細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，觀察其對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞因子分泌及緊密連接蛋白表達(dá)等功能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：2種細(xì)菌的培養(yǎng)上清(代謝產(chǎn)物)均可有效抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡現(xiàn)象，增加炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌，提示某些細(xì)菌基礎(chǔ)代謝，如糖代謝、氨基酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物亦或終產(chǎn)物可能在其中發(fā)揮一定作用。Leonard等[9]利用代謝組學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)不同菌株S.pneumonia培養(yǎng)上清(即體外代謝分泌物)中含有大量細(xì)菌基礎(chǔ)代謝相關(guān)產(chǎn)物，如甲酸、乳酸、乙醇等物質(zhì)，其中甲酸等有機(jī)酸可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。本研究中，上述2種細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激組的A549細(xì)胞培養(yǎng)基與未刺激組細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)酸堿度未出現(xiàn)明顯改變(結(jié)果未展示)，故此可基本排除因酸堿度改變所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制及凋亡效應(yīng)，同時(shí)提示甲酸等代謝產(chǎn)物可能通過(guò)復(fù)雜機(jī)制誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另有報(bào)道S.aureus代謝過(guò)程中產(chǎn)生的丙酮酸可引起細(xì)菌整體代謝通量的變化進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌致病性[11]。細(xì)菌培養(yǎng)上清中除含有細(xì)菌代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物與終產(chǎn)物外，還包括細(xì)菌合成并分泌到胞外的蛋白類(lèi)等物質(zhì)，其中S.aureus分泌的多種毒素，如葡萄球菌腸毒素和α-毒素等被報(bào)道可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死的發(fā)生，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌[12-13]。文獻(xiàn)報(bào)道S.aureus胞外分泌蛋白V8以及特定S.aureus菌株細(xì)胞培養(yǎng)上清可分別降低A549細(xì)胞，原代人鼻上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1，Claudin1的表達(dá)，破壞上皮細(xì)胞緊密連接完整性[14-15]，細(xì)菌培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)超濾濃縮后可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)下調(diào)[16]。本實(shí)驗(yàn)中未明顯觀察到兩種細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響可能原因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)上清未進(jìn)行超濾濃縮，相關(guān)作用蛋白濃度不足所致。

圖 1S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(n=6)

Fig1Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon the proliferation of A549 cells(n=6)

A.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，其中細(xì)菌培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組，加入相同體積細(xì)菌空白培養(yǎng)基；B.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001

圖 2S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響(n=3)

Fig2Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon apoptosis and necrosis of A549 cells(n=3)

A.S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞凋亡與壞死的影響，其中陰性對(duì)照組加入相同體積細(xì)菌空白培養(yǎng)基；B：兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)細(xì)胞凋亡與壞死的影響；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001

圖 3S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)炎癥細(xì)胞因子分泌功能的影響(n=3)

Fig3Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon the secretion of inflammatory cytokines by A549 cells(n=3)

A.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-6的影響;B.不同體積S.aureus/S.pneumonia細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8的影響;C.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-6的影響;D.兩種細(xì)菌裂解物、細(xì)菌滅活菌體對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8的影響; 與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001

細(xì)菌經(jīng)過(guò)超聲破碎處理后獲得細(xì)菌裂解物，其主要成分為細(xì)菌胞內(nèi)的非分泌性蛋白等物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，S.pneumonia裂解物可顯著抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其壞死和凋亡比例增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，S.pneumonia多種毒力因子，如肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，Ply)作為一種胞內(nèi)蛋白，可以通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)多種宿主細(xì)胞凋亡并促進(jìn)病原菌的感染[17-19]，神經(jīng)氨酸酶(microbial neuraminidases, NA)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、損傷方面同樣發(fā)揮重要作用[20]。上述細(xì)菌成分以及S.pneumonia其他胞內(nèi)重要毒力因子，如S.pneumonia肽鏈內(nèi)切酶等均可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8分泌[21-22]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。目前研究較為明確的S.aureus重要毒力因子主要為其分泌的多種外毒素、細(xì)胞壁蛋白成分，上述成分可促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌IL-6[23-24]，且前者可一定程度上存在于細(xì)菌胞漿部位(細(xì)菌裂解物)，可能在S.aureus裂解物刺激A549細(xì)胞分泌IL-6中發(fā)揮重要作用，其余發(fā)揮作用的胞內(nèi)蛋白仍待進(jìn)一步探究。

經(jīng)甲醛滅活的兩種細(xì)菌菌體對(duì)于A549細(xì)胞增殖、凋亡與壞死均未表現(xiàn)出明顯影響，但S.aureus滅活菌體可誘導(dǎo)A549細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平的下調(diào)，輕度抑制其他兩種緊密連接蛋白Claudin1、Occludin的表達(dá)。McLoughlin等[25]報(bào)道，滅活S.aureus菌體可降低人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，而S.aureus細(xì)胞壁重要致病物質(zhì)葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SpA)在其中并未發(fā)揮主導(dǎo)作用。S.aureus及S.pneumonia均為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，其細(xì)胞壁成分中的脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)作為細(xì)菌重要致病物質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道其單獨(dú)作用于角質(zhì)形成細(xì)胞并不能影響其緊密連接蛋白基因表達(dá)水平的改變[26]，故對(duì)于S.aureus菌體中引起上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)的主要物質(zhì)仍需新一步明確。另外S.pneumonia細(xì)胞壁成分中另一重要毒力因子為細(xì)菌莢膜，本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用S.pneumonia菌體進(jìn)行細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)未引起A549細(xì)胞上述結(jié)構(gòu)和功能的改變，提示細(xì)菌莢膜可能在機(jī)體突破黏膜免疫屏障，進(jìn)入機(jī)體引發(fā)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答階段發(fā)揮重要作用。

圖 4S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響(n=3)

Fig4Effects of different components ofS.aureus/S.pneumoniaon tight junction proteins ZO-1, Occludin and Claudin1 expressed by A549 cells(n=3)

A.Western Blot方法檢測(cè)S.aureus/S.pneumonia不同成分對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，Claudin1蛋白表達(dá)的影響; B.Western Blot結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖，目的蛋白條帶灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參灰度值反映各組蛋白相對(duì)表達(dá)的變化; C～E.細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)A549在不同細(xì)菌成分刺激下緊密連接蛋白ZO-1(C)，Occludin(D)，Claudin1(E)表達(dá)鏡下圖，其中藍(lán)色為DAPI染色，顯示細(xì)胞核成分；紅色、綠色熒光分別為目的蛋白，放大倍數(shù)為×630; 與陰性對(duì)照比較，*P<0.01

綜上所述，S.aureus和S.pneumonia感染過(guò)程中，不同細(xì)菌及細(xì)菌的不同成分對(duì)上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響并不完全相同。細(xì)菌培養(yǎng)上清、裂解物主要影響上皮細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌等功能，在本實(shí)驗(yàn)條件下S.pneumonia裂解物對(duì)于上述功能的影響略強(qiáng)于S.aureus裂解物的作用(對(duì)于IL-6分泌的影響除外)；僅S.aureus滅活菌體可降低緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)進(jìn)而影響上皮細(xì)胞間緊密連接的完整性。

本研究將細(xì)菌致病成分具體化，分為細(xì)菌代謝產(chǎn)物、細(xì)菌裂解物、細(xì)菌菌體3種組分，分別作用于呼吸系統(tǒng)疾病研究中廣泛使用的細(xì)胞株-人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)[27-29]，探究對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的影響。傳統(tǒng)的體外活細(xì)菌感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)側(cè)重于感染對(duì)機(jī)體損傷作用結(jié)果的研究，本研究方法在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了對(duì)細(xì)菌致病成分的分析與探究。實(shí)驗(yàn)后續(xù)將通過(guò)細(xì)菌代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)譜等研究方法對(duì)上述不同細(xì)菌成分進(jìn)一步具體化，明確細(xì)菌感染過(guò)程中重要的致病物質(zhì)及其致病機(jī)制。該研究將為臨床S.aureus和S.pneumonia感染的防控、疫苗的制定以及細(xì)菌感染后的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。