循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤DNA在胃癌中的研究進(jìn)展

馬曉溪綜述，胡瑩，普婭坤，周濤審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650101)

在我國，2015年新確診的胃癌病例約679100例，其中死亡人數(shù)超過498000例[1]。盡管近年來對于胃癌的診斷和治療有了較大改進(jìn)，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%，并且大約50%的胃癌患者在手術(shù)治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。早期GC的治療策略包括外科手術(shù)及放化學(xué)療法，而對于進(jìn)展期胃癌(Advanced gastric cancer，AGC)治療的主要策略為化療和靶向治療。不幸的是，超過40%的AGC患者對化療藥物不敏感，其他患者則迅速產(chǎn)生耐藥，這使得患者的生存率低且治療方法的選擇有限[3]。因此，探索新的可靠生物標(biāo)志物對于提高GC患者的早期診出率和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的預(yù)測準(zhǔn)確率極為重要，且能更好地監(jiān)測GC患者的治療反應(yīng)，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量。

當(dāng)下三種熱門的非侵入性液態(tài)活檢方法中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumour cell,CTCs)和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)因其具備微創(chuàng)性、易獲得性和可重復(fù)性等優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注[4]。相關(guān)研究顯示在腫瘤的早期階段，即有腫瘤細(xì)胞和DNA釋放至外周血，形成CTCss及游離DNA,且其與腫瘤患者的無進(jìn)展生存期(Progression Free Survival,PFS)和總生存期(Overall Survival,OS)明顯相關(guān)[5]，這為我們對胃癌的早期診斷、療效監(jiān)測及評估預(yù)后的進(jìn)一步研究提供了新的平臺。本文就胃癌中CTCs和ctDNA的生物學(xué)特性、檢測方法及臨床意義進(jìn)行了綜述。

1 CTCs

1.1 生物學(xué)特性 CTCs是經(jīng)過內(nèi)滲作用進(jìn)入外周血液的脫離原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)似乎參與了這項活動，它能增強腫瘤細(xì)胞的可塑性和遷移能力，協(xié)助CTCss進(jìn)入血液循環(huán)，加速腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，并非所有的CTCss都有可能發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶，大部分進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞被宿主自身的免疫系統(tǒng)清除或因血流剪切力而死亡，只有一小部分具有干細(xì)胞樣或上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換特性的腫瘤細(xì)胞可以存活并遷移到遠(yuǎn)處以形成繼發(fā)性腫瘤[6]。因此，外周血循環(huán)中檢測到CTCs可作為癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的標(biāo)識。

1.2 富集和檢測 在癌癥患者的血液中，CTCss相對于其它細(xì)胞濃度較低，因此，需要非常靈敏的方法來檢測并計數(shù)由包括GC在內(nèi)的各種惡性腫瘤產(chǎn)生的CTCss。CTCss檢測一般分為兩步：分離富集和檢測。一般來說，富集是基于物理的(如大小或密度)或生物學(xué)的(如存在特殊的蛋白質(zhì))特性來捕獲CTCss，也可以將二者結(jié)合起來，以提高CTCss的檢測準(zhǔn)確性。富集之后，CTCss能夠被基于核酸的測定方法(定量實時聚合酶鏈反應(yīng)，qRT-PCR)或基于細(xì)胞識別的測定方法檢測到。qRT-PCR方法被認(rèn)為是檢測腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物 (如mRNAs)最敏感的方法，可在1-1000萬個正常細(xì)胞(1-10毫升血液)中檢測到一個癌細(xì)胞，與qRT-PCR相比，基于細(xì)胞識別的測定方法 (例如免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù))可進(jìn)行CTCss計數(shù)并對細(xì)胞的形態(tài)及分子特征進(jìn)行分析[7]。The CellSearch系統(tǒng)是美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的唯一一種基于免疫磁珠捕獲上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的用于富集和檢測CTC-ss的系統(tǒng)。Grover[8]等使用這種技術(shù)檢測了403名轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的血液樣本，其中26%的患者檢出CTCss。然而，該方法也存在局限性，它不能檢測表達(dá)水平低的EpCAM和非上皮表型 (如循環(huán)腫瘤干細(xì)胞的CTCss)。

目前有許多關(guān)于CTCss檢測的替代方法正在研究中，如 CTCs芯片、“人字形芯片”等[9]。但是，由于每種富集方法可能捕獲不同的CTCss群體[10]，故臨床使用標(biāo)準(zhǔn)化方法是極為必要的。

2 ctDNA

2.1 生物學(xué)特性 循環(huán)游離DNA(circulating cellfree DNA，cfDNA)是一種胞外DNA，以單鏈或雙鏈DNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物等形式存在于血液、腦脊液等體液中，部分來源于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤。來自CTCss的cfDNA也稱為ctDNA，包含腫瘤基因的不同片段，這些片段可能會引起癌癥的特異性基因或表觀遺傳的變異，例如甲基化或突變。ctDNA的平均長度約為140個核苷酸，比非腫瘤cfDNA短(約166bp)，長度上的差異可使ctDNA從非腫瘤cfDNA中分離出來[11]。目前，關(guān)于腫瘤患者ctDNA的來源主要有以下三個觀點：①細(xì)胞凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞；②循環(huán)血液或轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的溶解；③腫瘤細(xì)胞不斷釋放DNA進(jìn)入血液循環(huán)。

2.2 檢測 一般情況下，血液中ctDNA的含量很少，基因常規(guī)測序技術(shù)的靈敏度較低，如Sanger測序等檢測方法。隨著數(shù)字PCR和大規(guī)模并行測序(MPS)等新技術(shù)的出現(xiàn)，ctDNA檢測的靈敏度得到了顯著提高。數(shù)字PCR與常規(guī)PCR的不同之處在于，它是一次分配一個樣品DNA分子到用于擴(kuò)增和檢測的單個微體積反應(yīng)中，以實現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，該技術(shù)已用于卵巢癌、胰腺癌等癌癥的ctDNA分析[12]。該方法的優(yōu)點是可以對ctDNA進(jìn)行絕對定量，缺點是能檢測到的突變點的數(shù)量有限且通量低。MPS是一組能夠同時處理多個DNA序列的技術(shù)，典型運行的MPS儀器產(chǎn)生數(shù)億至數(shù)千兆堿基的核苷酸序列數(shù)據(jù)，靈敏度為0.001%(1/100,000拷貝)。它的高靈敏度和高通量特點使其成為評估血液中低水平ctDNA的有力手段[13]。目前，基于MPS的ctDNA分析的主要內(nèi)容是對數(shù)十至數(shù)百個癌癥基因的體細(xì)胞突變進(jìn)行基因面板分析。最新的基于MPS的ctDNA測試平臺包括Safe序列、Tam序列、CAPP序列和Ampli序列等。

3 CTCs和ctDNA在胃癌中的應(yīng)用價值

傳統(tǒng)的組織活檢被認(rèn)為是臨床診斷癌癥的金標(biāo)準(zhǔn)，活檢標(biāo)本的病理學(xué)結(jié)果也為臨床決策提供了基本信息。然而，腫瘤標(biāo)本來源的局限性、腫瘤動態(tài)變化的侵入性和延遲性限制了其應(yīng)用。與傳統(tǒng)的病理組織活檢相比，檢測CTCs和ctDNA已經(jīng)被認(rèn)為是一種具有微創(chuàng)性、便捷性和可動態(tài)監(jiān)測腫瘤變化的液態(tài)活檢方式，目前已被用于癌癥管理的許多方面，例如監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、治療效果和預(yù)測癌癥患者的存活時間等。

3.1 CTCs和ctDNA在胃癌的診斷方面的價值 癌癥的早期診斷，特別是在轉(zhuǎn)移之前，對于降低癌癥相關(guān)死亡率至關(guān)重要。目前內(nèi)鏡檢查是臨床實踐中GC診斷最有效的方法，但其對GC篩查的敏感性僅為69.0%[14]并且存在一些突出的缺點。一些患者因害怕侵入性和手術(shù)而拒絕進(jìn)行必要的胃鏡檢查。通過胃鏡檢查在全國范圍內(nèi)對GC進(jìn)行篩查將對欠發(fā)達(dá)國家的衛(wèi)生預(yù)算造成沉重負(fù)擔(dān)，并且在低發(fā)病率地區(qū)也不合適。另一方面，一些患者因擔(dān)心胃癌發(fā)生而接受不必要的胃鏡檢查。因此，需要好的替代方法來識別用于胃鏡檢查的高風(fēng)險個體。一般來說，用液態(tài)活檢來評估、篩查一般人群是不現(xiàn)實的，但可能適合于高危人群(如家族性疾病患者)。

CTCs的檢測是一種有吸引力的替代方案，可提供可重復(fù)性和非侵入性檢測癌癥患者治療效果的能力，且能夠提示影像學(xué)未能發(fā)現(xiàn)的潛在病灶，這有助于患者的早期診斷及個體化治療，進(jìn)而提高胃癌患者的存活率。Hwa MK等[15]使用ROC曲線來確定用于區(qū)分胃癌患者和健康對照組的CTCs的最佳閾值水平，并將該閾值定義為每7.5mL血液≥2個CTCss，其敏感性和特異性值分別為85.3%和90.3%。許多學(xué)者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血的CTCs陽性率顯著高于胃良性疾病患者[15-17]。Tang等[18]為評估CTCs的檢測對于診斷GC的總體準(zhǔn)確性進(jìn)行了一項meta分析，結(jié)果顯示，CTCs檢測對GC診斷的特異性為99%。因此，用于GC檢測的CTCs的突出特征是其特異性較好，這在GC的診斷確認(rèn)中可能是有價值的。這些結(jié)果表明CTCs可能作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

過去十年中，在探索ctDNA在癌癥患者管理中的臨床應(yīng)用方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。基于ctDNA的液態(tài)活檢具有微創(chuàng)性和對癌癥基因組“實時快照”的特點，在診斷、監(jiān)測和評估治療效果等方面已經(jīng)顯示出比常規(guī)組織活檢更有效和更好的替代潛力。早期癌癥患者通常無癥狀，當(dāng)癌癥相關(guān)癥狀明顯時，治愈該疾病往往已為時已晚。一個5000萬癌細(xì)胞的腫瘤是無法通過成像檢測到的，它將DNA釋放到循環(huán)血液中，可以通過對循環(huán)血液中的ctDNA進(jìn)行分析而檢測到[19]。Yunhe Gao[20]等關(guān)于混合期胃癌的meta分析中顯示，ctDNA檢測在胃癌診斷特異性方面具有明顯優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者循環(huán)血中cfDNA通常較健康者高，且這部分患者cfDNA的生物學(xué)特征與腫瘤組織相同，說明腫瘤患者中循環(huán)腫瘤DNA是循環(huán)游離DNA的主要來源。Kim等人[21]證實GC患者血清cfDNA水平高于健康對照組，且用于診斷GC患者的敏感性為96.67%，特異性為94.11%。這些研究提示ctDNA可作為胃癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。Newman[22]等也在非小細(xì)胞肺癌的研究中證實了這一價值，他們用MPS的方法檢測非小細(xì)胞肺癌ctDNA中的突變體，其特異性為96%。值得注意的是，目前ctDNA檢測對早期癌癥的敏感性約為30%～40%[23]。因此，大多數(shù)I期和II期癌癥將不會被當(dāng)前的ctDNA分析方法所檢測到。

3.2 CTCs和ctDNA在胃癌的預(yù)后評估及療效監(jiān)測方面的價值 對于進(jìn)展期GC，盡管某些靶向治療和免疫抑制治療等方法具有很好的效果，但其預(yù)后仍然很差，即使是早期胃癌在治療后也會有20%-50%的幾率復(fù)發(fā)[24]。因此，可靠的預(yù)后因素對于確定有最大復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者和需要特殊監(jiān)測或治療的侵襲性疾病患者具有重要作用。

在胃癌的相關(guān)研究中，CTCs的檢出預(yù)示著胃癌患者具有更短的無進(jìn)展生存期和總生存期[25]。Uenosono等[26]使用CellSearch系統(tǒng)檢測了 251名GC患者的CTCss，結(jié)果表明CTCs陽性患者的無復(fù)發(fā)生存率和5年生存率顯著低于CTCs陰性患者。Wang等人[27]發(fā)現(xiàn)CTCs陽性的GC患者較CTCs陰性的GC患者復(fù)發(fā)率高，3年無病生存期短。一項meta分析顯示，CTCs在晚期GC中比早期GC更常見，在分化差的GC中比分化好或中等分化的GC更常見，并且與患者的無進(jìn)展生存期和總生存期顯著相關(guān)[28]。這些研究提示了CTCs可以作為監(jiān)測胃癌患者復(fù)發(fā)或預(yù)后的有效指標(biāo)。在日本，根據(jù)胃癌輔助化療試驗(ACTS-GC)的數(shù)據(jù)顯示，幾乎所有接受胃切除術(shù)后的患有II期或III期腫瘤的患者均接受輔助化療[29]，然而，在沒有輔助化療的情況下，該階段約60%的患者沒有復(fù)發(fā)。如果可以預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)，那么有關(guān)CTCs的信息就可以幫助患者避免不必要的輔助化療。目前，一些研究已經(jīng)提示了CTCs檢測在胃癌化療期間的預(yù)測價值。Li[30]等在15名AGC患者的治療期間監(jiān)測CTCss的動態(tài)變化，結(jié)果表明治療后有著持續(xù)低水平CTCss的患者或早期轉(zhuǎn)變?yōu)榈退紺TCss的患者預(yù)后較好；而具有持續(xù)較高水平CTCss的患者或在治療后轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高水平CTCss的患者預(yù)后較差，這意味著對所施用的治療效果有限。Zou等[31]的一項meta分析得出CTCs的狀態(tài)對單獨化療的胃癌患者有著顯著的預(yù)后價值。因此，評估CTCs可能是預(yù)測GC患者腫瘤預(yù)后和療效監(jiān)測的有效策略。

目前，需要連續(xù)的檢測來監(jiān)測癌癥的進(jìn)展。對于傳統(tǒng)的組織活檢來說，多次重復(fù)取樣通常是困難的，并且并非所有患者都能在疾病進(jìn)展時進(jìn)行組織活檢。而ctDNA因其能夠?qū)δ[瘤患者實現(xiàn)實時監(jiān)測而備受關(guān)注。Yunhe Gao[20]等研究表明，ctDNA檢出的患者相對于未檢出的患者，PFS和OS明顯縮短，ctDNA的存在還與胃癌的TNM分期顯著相關(guān)。另一項研究表明，對于接受GC治療性手術(shù)的患者，ctDNA水平與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[21]。Garcia-Murillas[32]等在評估ctDNA作為乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測因子研究中發(fā)現(xiàn)，80%的癌癥復(fù)發(fā)患者可以通過數(shù)字PCR和MPS檢測到ctDNA，平均約提前臨床復(fù)發(fā)7個月，而在沒有復(fù)發(fā)的患者中，96%沒有檢出ctDNA。這些數(shù)據(jù)提示血液ctDNA分析可以為癌癥的預(yù)后及進(jìn)展提供評估。ctDNA的另一個臨床潛力是確定化療方案、預(yù)測化療反應(yīng)以及確定耐藥機制。與放射成像或腫瘤標(biāo)志物相比，ctDNA半衰期短的特點能夠較好的用于癌癥的實時監(jiān)測。一項對53名轉(zhuǎn)移性胃腸道腫瘤患者的前瞻性研究表明，一線化療期間ctDNA的早期變化預(yù)示著后來的影像結(jié)果。ctDNA水平在第二周期前顯著降低，并與8～10周的CT結(jié)果相關(guān)[33]。基于血液的監(jiān)測是癌癥治療中的理想策略，因為它具有較小的侵襲性和能避免輻射暴露。且常規(guī)組織活檢獲得的遺傳信息可能不能提供整個癌癥基因組的完整特性，而癌癥基因組的不完全基因分型可能會導(dǎo)致患者診斷不準(zhǔn)確并阻礙其有效治療。研究顯示，ctDNA分析，特別是基于MPS的分析，在描述癌癥的空間和時間異質(zhì)性上比傳統(tǒng)組織活檢更具優(yōu)勢[34]。相關(guān)研究已經(jīng)報道，AGC的高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性會導(dǎo)致IHC和FISH之間或內(nèi)窺鏡活檢和切除的腫瘤標(biāo)本之間的結(jié)果不一致，克服這個問題的一個備選方案就是用ctDNA進(jìn)行分析[35]。Gao J[36]等用NGS分析了70例胃癌患者血漿ctDNA中her2的擴(kuò)增情況，結(jié)果與組織中IHC/FISH的總符合率為91.43%。70例患者中，僅4例ctDNA檢出her2陽性，其中1例接受曲妥珠單抗治療，病情穩(wěn)定。這表明對于檢測her2的擴(kuò)增情況，血漿ctDNA與組織活檢有較高的一致性。

4 展望

綜上所述，基于CTCs、ctDNA血液腫瘤標(biāo)記物的液態(tài)活檢具有微創(chuàng)性、易獲得性和可重復(fù)性等優(yōu)勢，且對胃癌的診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估具有重要意義，但由于這些生物標(biāo)記物在血液中的濃度較低，缺乏靈敏度較好的檢測方法，且在技術(shù)方法上缺乏共識，沒有普遍接受的“金標(biāo)準(zhǔn)”，使各實驗室間檢測的靈敏度和特異性等相關(guān)性能差別較大，不能很好的對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，這使得CTCs及ctDNA應(yīng)用于常規(guī)臨床試驗的工作受到阻礙。因此，必須在臨床試驗中驗證更好的檢測方法，盡量減少假陰性和假陽性等問題的發(fā)生，以便早日實現(xiàn)臨床的有效性和實用性。