非編碼RNA在調控心臟細胞死亡相關的心血管疾病中的作用

董妍涵,王 昆

(青島大學轉化醫(yī)學研究院,山東青島266021)

心血管疾病是導致全球發(fā)病率和死亡率上升的嚴重問題.心肌細胞的損失與多種細胞死亡和存活過程相關,包括細胞凋亡、自噬和壞死,同時牽涉不同的調節(jié)通路[1].在過去的幾十年中,人類不斷探索心肌細胞死亡的調節(jié)機制以改善心臟衰竭.線粒體是心肌細胞中活性氧物質和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的主要生成來源[2],其形態(tài)變化與細胞死亡過程緊密相關.

在通常情況下,非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是一類來自非編碼區(qū)的RNA.根據(jù)長度分為兩大類：長鏈非編碼RNA(長度超過200 nt的lncRNA,long ncRNAs)；短鏈非編碼RNA(＜200 nt),包括miRNA(microRNAs),siRNA(short interfering RNAs),piRNA(piwi-interacting RNAs)等[3],其中miRNA是一類小的(22～24 nt)高度保守的非編碼RNA,通過堿基互補配對結合mRNA的3’或5’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTRs),從而抑制蛋白翻譯或促進mRNA降解來介導轉錄后基因沉默[3-5].早期,Berezikov等[6]和Graves等[7]詳細介紹了miRNA的產(chǎn)生過程.越來越多的證據(jù)表明,許多miRNA通過調節(jié)心肌細胞死亡的信號通路來參與心臟疾病的發(fā)展進程.

1 非編碼RNA與細胞凋亡相關的心臟疾病

細胞的死亡模式主要有3種：凋亡、自噬和壞死[8-9],其中細胞凋亡也稱為程序性細胞死亡,是一種物種間高度保守的生物調節(jié)過程[9],它的激活主要通過兩種不同的信號途徑,即外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑.細胞凋亡信號通路被激活后,通常伴隨著結構變化,包括細胞皺縮、核濃縮和DNA斷裂,最終導致細胞完全破壞[10].

已有研究表明,細胞凋亡與基因的表達紊亂相關,會導致心臟病變[11].近年來,在心肌病的發(fā)病機制中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的miRNAs參與細胞凋亡信號通路的調控.例如,miR-133可通過負調節(jié)caspase-9來抵抗H2O2引發(fā)的細胞凋亡[12],過表達miR-133a可抑制心肌纖維化[13].此外,miR-1在人的梗死心臟中下調[14],敲低miR-1可以抑制心律失常[15],細胞水平過表達miR-1可以通過靶向抗凋亡蛋白Bcl-2來促進氧化應激下的細胞凋亡[16].近期研究發(fā)現(xiàn),miR-181c參與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導的細胞凋亡,并通過靶向Bcl-2導致心力衰竭[17].此外,miR-21,miR-320,miR-199a和miR-30通過靶向不同的凋亡相關蛋白促進心臟細胞凋亡程序[18-21].活性氧(reactive oxygen species,ROS)可以氧化修飾miR-184,從而識別Bcl-xL和Bcl-w[22].在心梗模型小鼠中的進一步實驗證明,氧化的miR-184與Bcl-xL和Bcl-w的配對加重了ROS誘導的心肌組織損傷.

眾所周知,線粒體不斷地通過分裂和融合來應對不同的環(huán)境變化.已有研究表明,線粒體的分裂/融合能夠分別促進或抑制心肌細胞的凋亡[23-24].在心臟中,線粒體凋亡途徑同時也受多種miRNA的調控.例如,線粒體融合蛋白(Mitofusion1,Mfn1)是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白之一,可以調控心肌細胞中的線粒體分裂和細胞死亡[25].Li等[26]通過建立小鼠心梗模型,發(fā)現(xiàn)miR-140通過直接結合在Mfn1的3’UTR來抑制Mfn1的表達.同樣地,動力相關蛋白-1(dynamin-related protein-1,Drp-1)是細胞凋亡過程中調控線粒體分裂的關鍵節(jié)點[27],小鼠體內Drp-1的沉默可以顯著減少心臟經(jīng)缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷后的梗死面積[28].據(jù)報道,miR-499在心臟缺血性損傷風險區(qū)域中下調,心臟中過表達miR-499會抑制由鈣調磷酸酶介導的Drp-1蛋白的去磷酸化,從而改善心肌梗死的發(fā)病程度[29].Pink1作為絲氨酸/蘇氨酸激酶,是調節(jié)線粒體分裂/融合的重要基因[30].近期研究發(fā)現(xiàn),E2F1,miR-421和Pink1之間相互作用組成一條信號軸,調控線粒體形態(tài)和心肌細胞凋亡[2].MiR-421通過抑制Pink1翻譯來促進線粒體碎片化、細胞凋亡和心肌梗死.在線粒體凋亡通路中,由miR-361和PHB1組成的另一條信號軸也可通過抑制線粒體分裂和細胞凋亡來保護缺血損傷的心臟[31].到目前為止,盡管許多調節(jié)心肌細胞存活平衡的miRNA已經(jīng)被挖掘,但心臟中線粒體通路的分子機制仍需不斷探索.

其他類型的非編碼RNA,如長鏈非編碼RNA(lncRNAs)和環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNAs)被認為是心血管疾病凋亡途徑中新的調節(jié)分子.LncRNAs是一組長度大于200 nt的RNA,位于整個基因組中,極少具備編碼蛋白的能力[32].LncRNAs具有多種細胞功能,例如捕獲miRNAs、調控轉錄因子和影響染色質的三維結構[33-34].同時,lncRNAs參與多種生物過程,包括染色質修飾、基因組印記和細胞命運等[35].例如,lncRNA-Braveheart和Fendrr在心肌細胞分化過程中發(fā)揮關鍵作用[36-37].然而,關于lncRNAs在心肌細胞死亡中所起作用的相關研究目前比較有限.近期研究發(fā)現(xiàn)了一個心臟細胞凋亡相關的lncRNA(cardiac apoptosis-related lncRNA,CARL)可作為一種內源性的miR-539吸附海綿[38].MiR-539可直接靶向PHB2,而PHB2的抑制可促進線粒體裂變和細胞凋亡[38].CARL能夠通過調節(jié)miR-539/PHB2途徑來抑制線粒體分裂和細胞凋亡.另一類非編碼RNA,環(huán)狀RNA(circRNAs)的3’與5’端可以連接起來形成一個封閉的環(huán)形[39].已有研究指出,cirRNAs參與多種細胞調控過程,通過堿基互補配對作為miRNAs的一種競爭性內源RNA[40].然而,circRNAs在心肌細胞凋亡中的作用還有待研究.到目前為止,只有一個心臟相關circRNA(heart-related circRNA,HRCR)被鑒定為凋亡途徑的潛在調節(jié)分子[41].在該研究中,HRCR通過直接結合miR-223并抑制其活性而作為內源性miR-223海綿.MiR-223主要通過抑制抗凋亡蛋白Arc來促進心肌肥大和心臟衰竭.抗凋亡蛋白Arc是具有Caspase募集結構域(Caspase recruitment domain,CARD)的凋亡抑制因子,在心臟中高度表達并且抑制細胞凋亡[42-43].

2 非編碼RNA調節(jié)心肌細胞自噬

自噬是一種保守的細胞內循環(huán)過程,主要是失去功能的蛋白質和細胞器被運送至溶酶體進行降解的過程[44].細胞通過自噬可以將生成的大分子再循環(huán)釋放到胞質中以供生物合成途徑中的重復使用.自噬通過兩種主要途徑調節(jié)：Beclin-1和mTOR信號通路.

自噬通常用于維持細胞穩(wěn)態(tài),其功能障礙可導致心血管疾病.自噬功能障礙會影響心肌細胞線粒體的更新,從而導致心臟能量供給的缺乏[45].到目前為止,已經(jīng)有多種miRNA被證實與自噬途徑和心臟病理學相關聯(lián).由Beclin-1激活的自噬可誘導細胞死亡和心臟紊亂.例如,ARC作為Beclin-1的抑制劑,在壓力超負荷引起的心衰中,減少了自噬細胞的死亡和心梗梗死面積[46].生物信息學分析和進一步的實驗表明,miR-325通過靶向ARC干擾自噬途徑.有趣的是,miR-325作為轉錄因子E2F1的下游起作用.另一項研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)會導致miR-30a表達下調,Beclin-1作為miR-30a的靶蛋白被釋放出來,導致細胞過度自噬以及隨后的心肌細胞肥大.細胞中miR-30a的類似物可以通過抑制Beclin-1的表達從而逆轉AngⅡ誘導的心肌肥大[47].另一方面,抑制mTOR的活性能夠促進自噬和動物心梗[48].在心衰時,miR-221通過調節(jié)p27/CDK2/mTOR軸干擾自噬平衡和心肌重塑[49].MiR-99a的過表達能夠減弱mTOR的活性,減少心肌梗死面積并改善心功能[50].

在臨床上,肥厚型心肌病患者和健康捐贈者心臟組織的miRNA芯片結果顯示,在疾病狀態(tài)下miR-451的表達水平下降[51].但是,過表達miR-451時,靶蛋白結節(jié)性硬化癥復合體1(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)會加速心臟肥大,這是一種已知的自噬正調節(jié)劑.在另一項研究中,心肌細胞特異性過表達miR-212/132會影響正常的自噬反應并通過負調節(jié)叉頭轉錄因子3(forkhead box O3,FOXO3)的表達,導致促肥大鈣調神經(jīng)磷酸酶活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)途徑的過度活躍.最近,miR-22被鑒定作為心臟自噬的抑制劑,被認為是有開發(fā)潛力的臨床心肌梗死的治療和預后工具[52].近期研究發(fā)現(xiàn),lncRNAs也參與心肌細胞自噬的調節(jié)過程.一個名為自噬促進因子(autophagy promoting factor,lncRNA-APF)的lncRNA被發(fā)現(xiàn)[53],該lncRNA具備miR-188-3p的結合位點.進一步的實驗揭示APF,miR-188-3p和自噬相關蛋白(autophagy related protein 7,ATG7)構成了一個新的心臟自噬程序調節(jié)軸,影響自噬細胞死亡和心肌梗死.

3 非編碼RNA調節(jié)細胞壞死相關的心血管疾病

細胞體積增加、細胞器腫脹、質膜破裂和細胞內容物泄漏是壞死的形態(tài)學特征[54].長期以來,壞死通常被視為被動、偶然和不受管制的事件.近年來,越來越多的證據(jù)表明,壞死也可以由細胞編程.最近,一種相對新形式的壞死被定義為程序性壞死或壞死性凋亡,主要依賴受體相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIP1)和RIP3的獨特信號轉導途徑[54-55].在心肌細胞中,壞死誘導的細胞內容物釋放會引發(fā)炎癥反應及病理反應,如心肌梗死和心力衰竭[56].心臟的缺血性損傷經(jīng)常導致細胞內鈣超載和ATP消耗,隨后導致線粒體的線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放.親環(huán)蛋白D(cyclophilin D),是mPTP的關鍵調節(jié)因子[57].抑制小鼠中的cyclophilin D能減少I/R損傷后的梗死面積,并且還有助于抵抗線粒體通透性的轉變[58].已有研究發(fā)現(xiàn),miR-30b通過靶向抑制cyclophilin D的翻譯來減弱cyclophilin D誘導的心肌細胞壞死[59].此外,E2F1可負調控miR-30b的表達,表明由E2F1,miR-30b和cyclophilin D組成新的壞死調節(jié)信號軸[59].心肌細胞祖細胞(cardiomycyte progenitor cells,CMPCs)為受損心肌提供潛在的細胞來源.當CMPCs暴露于H2O2時,miR-155的表達上調,過表達miR-155時,可以阻斷RIP1,從而引發(fā)抗壞死反應.該發(fā)現(xiàn)揭示了miR-155可作為移植療法的治療靶標[60].近年來,一些研究小組提供了調節(jié)心肌細胞壞死發(fā)病機制的復雜信號轉導機制的一種新見解.Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)負調節(jié)RIP1-RIP3復合物和壞死的形成[61].MiR-103/107通過干擾FADD的表達進而影響心臟中氧化應激誘導的細胞壞死和心肌梗死面積.進一步的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),lncRNA-H19含有miR-103/107的識別位點.細胞中過表達或敲低H19的實驗證實,H19的表達與細胞對壞死死亡模式的敏感性之間呈負相關.進一步揭示了一種調節(jié)心肌細胞壞死樣凋亡的新通路,該通路由H19,miR-103/107和FADD組成[62].最近,由p53/lncRNA-NRF/miR-873/RIP(NRF為核呼吸因子,nuclear respiratory factor)組成的信號軸引起了研究者的關注[63],在該信號轉導通路中,p53轉錄激活lncRNA-NRF,而NRF可作為miR-873的內源性吸附海綿,從而抑制RIP1//RIP3的翻譯.lncRNA-NRF的過表達會導致心肌細胞壞死性死亡和I/R損傷后心肌梗死面積的增加.

4 三種細胞死亡模式之間的相互作用

在不同的應激條件下,細胞會發(fā)生凋亡、自噬和壞死.在通常情況下,輕度應激條件誘導細胞發(fā)生自噬；而在進行性應激條件下,細胞發(fā)生程序性凋亡；在進一步的極端環(huán)境中,ATP消耗與細胞壞死同時發(fā)生[64].線粒體通常作為細胞自噬和凋亡模式切換的轉換器[64],因此同一個細胞應激因子可以同時激活細胞凋亡和自噬的不同信號通路.例如,ROS在細胞凋亡中起關鍵作用[65],同樣地,ROS也可以通過影響Atg4的活性誘導細胞自噬[66].此外,信號通路的某些節(jié)點基因,如Beclin-1/Bcl-2[67],p53[68]和caspase-8,在細胞凋亡/自噬/壞死之間的轉換中起作用.Nix是一種Bcl-2家族蛋白,可以介導細胞凋亡或壞死[69].另一項研究指出,Bax/Bak是Bcl-2家族的其他成員,已知Bax和Bak在I/R損傷時激活細胞凋亡,它的沉默導致抵抗mPTP開放和壞死[70].

某些miRNA可能同時參與不同的細胞死亡過程.例如,miR-497可抑制抗凋亡蛋白Bcl2和自噬基因LC3B,促進細胞凋亡并減少細胞自噬的發(fā)生[71].Let-7b通過抑制caspase-3,進而抑制移植到I/R損傷心臟中的人間充質干細胞的凋亡和自噬[72].Sirt1是miR-34a的靶點,并且能夠通過p53和ROS信號途徑影響細胞凋亡.此外,Sirt1通過調節(jié)p53和FOXO轉錄因子的活性參與自噬[73].

5 展望

心血管疾病的發(fā)展是一個涉及多種細胞過程的復雜過程.本工作揭示了非編碼RNA通過參與細胞的凋亡、自噬和壞死相關的信號通路從而調控心肌細胞的存活/死亡,具備廣泛應用于臨床治療心臟病的潛力.阻斷細胞凋亡或壞死可能是心臟病的有效治療策略.而且,非編碼RNA的類似物或抑制劑易于合成,體內轉染的細胞毒性低,有望成為治療人類心臟病的潛在治療靶標.但是,基于非編碼RNA療法的發(fā)展仍有許多問題和挑戰(zhàn)需要解決,例如脫靶效應.目前,一些心血管相關miRNA已被用作心臟病的診斷標志物[74].在未來的研究中,仍需進一步探索在不同心肌病理狀態(tài)下,非編碼RNA和不同心肌細胞死亡形式相關聯(lián)的復雜機制.