正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選痛風(fēng)巴布膏劑的提取工藝

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1.貴州省清鎮(zhèn)市中醫(yī)醫(yī)院， 貴州 清鎮(zhèn) 551400；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

馬錢子為馬錢子科植物馬錢(Strychnosnux-vomicaL .)的干燥成熟種子，馬錢子堿為其主要有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛作用。馬錢子味苦，性溫,有大毒。具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功能[1]，臨床上常用馬錢子等藥物治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、肌肉疼痛等癥。其中，痛風(fēng)是一種臨床綜合征，主要是由于尿酸排泄減少或嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸升高，最典型、最常見的臨床表現(xiàn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、后期形成的痛風(fēng)結(jié)石。痛風(fēng)的患病率隨著人們生活水平的提高，較以往呈現(xiàn)明顯增高趨勢，40歲以上男性多發(fā)，常見第一跖趾關(guān)節(jié)，在其它較大關(guān)節(jié)也有發(fā)生，特別是是踝部與足部關(guān)節(jié)部位[2-3]。本醫(yī)院根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用制馬錢子、紅花、生半夏、生大黃等藥物組成的復(fù)方對痛風(fēng)癥治療，以洗劑形式進(jìn)行治療，但是洗劑給藥不便，且在一定程度上制約藥效的發(fā)揮，因此，為了改進(jìn)洗劑的弊端，使復(fù)方發(fā)揮更大的療效，本研究擬采用巴布膏劑，現(xiàn)以復(fù)方中馬錢子堿含量和出膏率為考察指標(biāo)，以提取時(shí)間、加水量、提取次數(shù)為影響因素，采用正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選痛風(fēng)巴布膏劑的最佳提取工藝，以期發(fā)揮更佳的臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate3000型高效液相色譜儀(賽默飛)，柱溫箱，WP-UP-WF-20微量分析型超純水機(jī)(淅川沃特浦水處理設(shè)備有限公司)，AUW220D型分析天平(十萬分之一)，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，600T多功能型粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)，101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯儀器有限公司)，YQ-1000A型超聲波清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥 馬錢子堿對照品(貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號GZDD-0543)；馬錢子(貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號20181203)紅花(貴州同濟(jì)堂藥店，批號180801)；生半夏(貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號20180904)；生大黃(貴陽一品藥業(yè)，批號180110)；王不留行(貴陽芝林大藥房，批號180802)；海桐皮(貴州同濟(jì)堂藥店，批號181-201)；艾葉(貴陽濟(jì)仁堂藥店，批號2018-1101)；冰片(貴州同濟(jì)堂藥店，批號180901)；痛風(fēng)巴布膏劑(清鎮(zhèn)市中醫(yī)院，批號190102、190-203、190310)；甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 根據(jù)痛風(fēng)巴布膏劑處方特點(diǎn)和臨床應(yīng)用，該經(jīng)驗(yàn)方為水煎煮后外用，臨床效果較好，為了與原方制備方法保持一致，對復(fù)方采用水煎煮提取后濃縮，即得復(fù)方濃縮液。

2.2 出膏率測定 將上述濃縮液置已干燥且恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，然后放入105℃烘箱內(nèi)干燥箱在中干燥至恒重后置干燥器中冷卻30 min，即得浸膏，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。出膏率(%)=干膏重量/原藥材重量×100%。

2.3 馬錢子堿的測定

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)(21:79)為流動(dòng)相；檢測波長為260 nm[8]。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱定馬錢子堿對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含馬錢子堿0.l mg。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱定本品干膏0.3 g，置5 mL具塞容量瓶，再加入5.0 mL三氯甲烷，攪拌至完全溶解，濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 按2.3.2項(xiàng)下對照品溶液制備方法制備對照品溶液，精密吸取對照品溶液1.0 μL、5.0 μL、9.0 μL、13.0 μL、15.0 μL，在2.3.1項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣，測定馬錢子堿峰面積，以進(jìn)樣量X(ug)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=26.566X+0.9126，r=0.9998。表明馬錢子堿在0.1～1.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算RSD為2.91%，表明該方法精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3.3項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，結(jié)果馬錢子含量的RSD為1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號的供試品溶液20 μL，依次在0、3、6、12、24 h進(jìn)樣,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算RSD為2.46%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知馬錢子堿含量的樣品6份，各0.15 g，分別加入0.1 mg/mL的馬錢子堿對照品溶液1.63 mL，按2.3.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液并測定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.5%，RSD為1.87%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.4 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.4.1 因素與水平 本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法提取，以馬錢子堿的含量作為評價(jià)指標(biāo)，選擇L9(33)正交實(shí)驗(yàn)對提取時(shí)間(A)、加水量(B)、提取次數(shù)(C)進(jìn)行優(yōu)選，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，共27次實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 因素水平表

2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 對9組實(shí)驗(yàn)，按2.1、2.2、2.3.1和2.3.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別測定馬錢子堿含量和干膏得率，并按照以下評分方程計(jì)算其綜合評分：綜合評分=馬錢子堿含量隸屬度×60+干膏得率隸屬度×40，(隸屬度=(指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值))。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，表3，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，考察因素A、B、C對綜合評分的主效應(yīng)。結(jié)果見表4。

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

從表4可知，因素A、B、C對綜合評分的主效應(yīng)不顯著(P>0.05)，由表3中極差R值可知，各因素的影響大小依次為C>B>A，且C3>C2>C1，B2>B3>B1，A1>A3>A2由于C3與C2差異不大，從節(jié)約能源，利于生產(chǎn)考慮，選擇提取2次更合適。綜合比較后，確定A1B2C2為痛風(fēng)巴布膏劑的最佳提取工藝，即10倍量的水，提取2次，每次0.5 h。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期對乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)、乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液、甲醇-十二烷基磺酸鈉-磷酸二氫鉀三種流動(dòng)相進(jìn)行了考察?？疾彀l(fā)現(xiàn)乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)黏性特別大，容易堵塞柱子；甲醇-十二烷基磺酸鈉-磷酸二氫鉀為流動(dòng)相時(shí)馬錢子堿的色譜峰與其他峰分不開，且拖尾嚴(yán)重；乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動(dòng)相時(shí)馬錢子堿的色譜峰與其他峰能較好的分開，且峰形較好。故本實(shí)驗(yàn)最終確定采用乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為測定指標(biāo)成分馬錢子堿的流動(dòng)相。

本研究使用的復(fù)方中選用的是制馬錢子，生馬錢子毒性大，僅供外用，且有毒成分能經(jīng)皮膚吸收，外用不宜大面積涂敷。馬錢子經(jīng)炮制后毒性降低，可入丸散劑，供內(nèi)服。制馬錢子中馬錢子堿的含量降低，馬錢子堿氮氧化物含量明顯增加，且馬錢子堿及其氮氧化物藥理作用相似，但馬錢子堿的毒性成分比其相應(yīng)的氮氧化物大15倍，而馬錢子氮氧化物的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于馬錢子堿，且具有藥效發(fā)揮遲而藥力持久的特點(diǎn)[4]。因此，為了保證臨床用藥安全、有效，復(fù)方選用制馬錢子。以馬錢子堿的含量為控制指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛風(fēng)巴布膏劑最佳提取工藝為A1B2C2，即10倍量的水，提取2次，每次0.5 h。在此工藝下，馬錢子堿的含量為0.1481%，小于2015版藥典規(guī)定的含量，保證了臨床用藥安全。另外，本研究采用馬錢子堿和出膏率兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，能夠較全面地評價(jià)痛風(fēng)巴布膏劑的提取工藝，且方法簡單、成本低、精密度高，重現(xiàn)性好，為日后痛風(fēng)巴布膏劑的研制奠定了基礎(chǔ)。