MTH1抑制劑TH287對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制作用及其機(jī)制

詹丹凱,張新鑫,賈建光

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:jiajianguang1978@126.com)

癌細(xì)胞由于氧化還原失調(diào)產(chǎn)生大量活性氧損傷DNA、RNA以及游離核苷酸。損傷的核苷酸一旦插入到DNA當(dāng)中,將會(huì)進(jìn)一步造成DNA損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。此外,氧化應(yīng)激與人類基因組的穩(wěn)定性和疾病有關(guān)[2]。氧化損傷的堿基一旦插入DNA鏈中,將會(huì)誘發(fā)DNA損傷,這將會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。8-氧化鳥嘌呤(8-oxo-G)是最常見的氧化堿基,它容易與腺嘌呤(adenine,A)發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì),從而導(dǎo)致DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)翻譯錯(cuò)誤。此外,8-氧化鳥嘌呤還能夠調(diào)節(jié)端粒酶的活性,并且與癌癥和其他疾病有關(guān)[3,4]。在正常氧化還原環(huán)境中,8-oxo-G能夠促進(jìn)端粒酶延長(zhǎng),而氧化應(yīng)激條件下,端粒會(huì)發(fā)生功能紊亂或者縮短,從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。

哺乳動(dòng)物中的MutT同源蛋白1(MTH1)是nudix水解酶家族成員之一,主要分布在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。它能夠水解包括8-氧化鳥嘌呤在內(nèi)的氧化嘌呤三磷酸核苷酸,從而阻止細(xì)胞損傷和死亡[6]。不僅如此,MTH1還能夠有效地水解甲基化堿基,阻止甲基化堿基插入DNA鏈中,以免干擾DNA正常復(fù)制和基因的正常表達(dá)[1,7-9]。近年來(lái),大量研究證實(shí),MTH1有望是癌癥治療中新的靶點(diǎn)。MTH1水平的變化可能與細(xì)胞損傷和疾病的發(fā)生有關(guān),MTH1表達(dá)水平下降可以導(dǎo)致8-OXO-G誘導(dǎo)的RNA損傷增加[10];而MTH1表達(dá)水平降低,可能與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的癌變有關(guān)[11]。調(diào)控MTH1水平或功能可能會(huì)成為癌癥治療的新途徑。

胃癌仍然是全世界最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在腫瘤中高居第五,死亡率高居第三[12,13]。盡管早期胃癌患者通過(guò)手術(shù)治療預(yù)后良好,然而進(jìn)展期胃癌因其復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移及耐藥等因素,其預(yù)后仍然堪憂。生物靶向治療儼然發(fā)展為現(xiàn)代腫瘤治療的重要手段,隨著對(duì)MTH1的研究不斷取得進(jìn)展和突破,TH588、TH287等MTH1小分子抑制劑,被認(rèn)為可以通過(guò)靶向MTH1殺死癌細(xì)胞[1,11,14]。據(jù)報(bào)道,MTH1功能失調(diào)時(shí)癌細(xì)胞存活率較低,因此,靶向MTH1活性可能是一種有效的治療策略[15-17]。本研究旨在探討MTH1抑制劑TH287對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。

1 方法與材料

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人胃癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)(中國(guó),上海)。胎牛血清購(gòu)自杭州天杭生物科技公司公司(中國(guó),杭州),RIPM1640液體培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(中國(guó),上海),100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素雙抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(中國(guó),上海),CCK-8試劑盒購(gòu)自亞科因生物技術(shù)公司(中國(guó),湖北)。BCA蛋白定量試劑盒及蛋白印跡(Western blot)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(中國(guó),上海)。Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒及線粒體膜電位試劑盒均購(gòu)自貝博生物公司(中國(guó),上海)。MTH1抑制劑TH287購(gòu)置Selleck生物科技公司(美國(guó),休斯頓)。Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、p-AKT多克隆抗體及二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司(中國(guó),武漢)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞株BGC-823在含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,10 U/ml鏈霉素的RIPM1640液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)在37 ℃,5% CO2環(huán)境培養(yǎng)箱。細(xì)胞每2 d換液,當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%-90%時(shí),PBS洗滌,用0.25%胰酶(含EDTA)消化并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或傳代。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化后用1640培養(yǎng)基重懸至7×104密度,充分混勻后按100 μl/孔接種于96孔板,最終細(xì)胞數(shù)為7 000/孔,最外緣孔加入同樣體積PBS,培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基換成含不同濃度TH287的培養(yǎng)基(0,4,8,16,32,64,128 μmol/L),另設(shè)空白組(只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞),所有組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中按不同時(shí)間段分別培養(yǎng)24，48，72 h，結(jié)束培養(yǎng)后，每孔加入10 μl CCK-8試劑并且繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并記錄結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用培養(yǎng)基重懸，按2 000個(gè)/皿接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成TH287濃度為0，0.5，1.0，1.5 μmol/L的培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)2周。棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定10 min，室溫晾干，結(jié)晶紫染色20 min，雙蒸水洗滌，在室溫晾干，拍照并記錄結(jié)果。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞密度至80%-90%密度時(shí),用10 μl規(guī)格槍頭劃痕,PBS小心洗滌2次去除漂浮細(xì)胞,顯微鏡拍照記錄為0 h。加入TH287濃度為0,4,16,64 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,顯微鏡下拍照記錄,計(jì)算細(xì)胞遷移率,遷移率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)TH287對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按5×104個(gè)/孔密度加入到Transwell小室上室中,下室加入0.6 ml含30%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)8 h至細(xì)胞貼壁，上室加入含不同濃度TH287(0，4，16，64 μmol/L)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定10 min并用結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽小心擦去小室上面細(xì)胞并用雙蒸水小心洗滌，室溫晾干，200倍顯微鏡下選取5個(gè)隨機(jī)視野拍照，用Image軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)取平均值。

1.7 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞融合至70%時(shí),棄培養(yǎng)基,用PBS洗2次,用含不同濃度TH287(0,4,16,64 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，提取總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，加入1×蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃變性。SDS-PAGE凝膠電泳并將蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST洗滌2次，5%脫脂牛奶封閉4 h，TBST洗滌，一抗(Bcl-2 1 ∶1 000,Bax 1 ∶1 000,PI3K 1 ∶500,Akt 1 ∶500,p-Akt 1 ∶500,GAPDH 1 ∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，5 min/次，二抗(山羊抗兔Ig抗體1 ∶5 000)室溫孵育2 h，洗滌后ECL顯影液顯影并暗室曝光。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

BGC-823細(xì)胞接種于6孔板,生長(zhǎng)至70%密度時(shí),用含不同濃度TH287(0,4,16,64 μmol/L)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h。用不含EDTA的胰酶消化并用冷的PBS洗2次,用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μl FITC,避光冰上孵育15 min,加入10 μl PI避光冰上孵育5 min,于孵育結(jié)束后1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 線粒體膜電位檢測(cè)

細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí),用含不同濃度TH287(0,4,16,64 μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,PBS洗滌2次,換新鮮培養(yǎng)液1 ml/孔,加入1 ml/孔JC-1染色工作液,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，棄上清，用預(yù)冷1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 ml新鮮培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下拍照。

1.10 SC79驗(yàn)證TH287對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的作用

為了證明TH287通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用,實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)AKT磷酸化激活劑SC79(5 μmol/L)預(yù)處理2 h,再用含TH287(64 μmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。對(duì)照組為含TH287(64 μmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h?？瞻讓?duì)照組不加藥。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡以及蛋白表達(dá)情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TH287降低細(xì)胞活力抑制BGC-823細(xì)胞增殖

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,TH287處理后BGC-823細(xì)胞活力降低,TH287濃度為0,4,8,16,32,64,128 μmol/L時(shí),隨著TH287濃度和作用時(shí)間增加,細(xì)胞活力不斷下降(P<0.05,見圖1),并且作用效果呈劑量和時(shí)間依賴性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組BGC-823的集落形成數(shù)量明顯比對(duì)照組少,并且TH287濃度越高,集落形成數(shù)量越少(見圖1)。TH287明顯抑制BGC-823增殖能力。

圖1 TH287對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823活力和克隆形成的影響Figure 1 Effect of TH287 on cell viability and clony formation of gastric cancer BGC-823

2.2 TH287抑制BGC-823細(xì)胞遷移

劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示,不同濃度TH287(0,4,16,64 μmol/L)作用下,24 h細(xì)胞遷移率分別為(28.67±1.48)%,(19.87±1.20)%,(10.70±2.18)%和(3.07±1.25)%。與0 μmol/L組比較,隨著TH287作用濃度的增加,BGC-823細(xì)胞遷移率逐漸下降(P<0.05);細(xì)胞遷移數(shù)目逐漸減少(P<0.01,見圖2)。TH287對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823遷移能力明顯抑制。

與0 μmol/L相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 TH287對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823遷移的影響Figure 2 Effect of TH287 on migration of BGC-823 cells

2.3 TH287誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位改變

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡,FITC水平反應(yīng)細(xì)胞早期凋亡率,PI水平則反應(yīng)晚期凋亡情況。結(jié)果顯示,4,16,64 μmol/L TH287處理后，細(xì)胞凋亡率分別為(18.88±1.45)%,(45.3±2.88)%,(59.8±4.78)%;與0 μmol/L相比,細(xì)胞凋亡凋亡比率明顯上升(P<0.01)。線粒體膜電位降低發(fā)生于細(xì)胞凋亡的早期,細(xì)胞線粒體的功能發(fā)生變化,檢測(cè)結(jié)果顯示,與0 μmol/L相比,隨著TH287濃度(4,16,64 μmol/L)的增加,紅光逐漸減弱,綠色熒光逐漸增強(qiáng)(見圖3,4),提示線粒體膜電位在逐漸降低,并且與TH287作用有關(guān)。

圖3 TH287對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡的影響Figure 3 Effect of TH287 on apoptosis of BGC-823 cells

圖4 不同濃度TH287對(duì)胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響Figure 4 Effect of TH287 on mitochondrial membrane potential in BGC-823 cells

2.4 TH287對(duì)凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,在不同濃度TH287作用下,BGC-823抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降,促凋亡蛋白Bax水平上升,Bcl-2/Bax比值下降(P<0.05);TH287抑制PI3K,磷酸化AKT(p-AKT)水平,并且p-AKT/AKT比值下降(P<0.05,見圖5)。表明TH287可能通過(guò)PI3K/AKT通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

與0 μmol/L相比,*P<0.05圖5 TH287對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白的影響Figure 5 Effect of TH287 on the apoptosis-associated protein and PI3K/p-AKT pathway-associated protein in BGC-823 cells

2.5 TH287通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步證明TH287是否通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞凋亡,胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)AKT磷酸化激活劑SC79預(yù)處理2 h。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,TH287單獨(dú)作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且抑制AKT磷酸化水平;與TH287對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組TH287聯(lián)合SC79作用,細(xì)胞活力增加,高于TH287組(P<0.01),并且凋亡比率也低于TH287單獨(dú)作用(P<0.05);在蛋白水平,與TH287單獨(dú)作用相比,TH287聯(lián)合SC79作用時(shí)AKT的磷酸化水平高于TH287單獨(dú)作用,p-AKT/AKT和Bcl-2/Bax比值增高(P<0.05,見圖6,7)。結(jié)果表明,SC79能夠抑制TH287對(duì)BGC-823的作用效果,提高AKT磷酸化水平,細(xì)胞凋亡減少。證明TH287可能是通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡的。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與TH287組比較，#P<0.05，##P<0.01圖6 AKT磷酸化激活劑SC79抑制TH287對(duì)胃癌細(xì)胞的作用Figure 6 SC79 partially reverses inhibitory effect of TH287 in BGC-823 cells

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與TH287組比較，#P<0.05圖7 SC79抑制TH287對(duì)胃癌細(xì)胞蛋白水平的作用Figure 7 SC79 partially reverses effects of TH287 on protein expression in BGC-823 cells

3 討論

胃癌已經(jīng)成為全球第三大高死亡率腫瘤,已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害人類健康[18]。進(jìn)展期胃癌,由于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥等原因,預(yù)后差,治療效果并不滿意[19]。目前多藥聯(lián)合化療是治療晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌癥的可行性方案,然而,胃癌患者由于對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性,療效及預(yù)后仍舊不佳[20]。近年來(lái),MTH1已經(jīng)被視為癌癥治療中的新靶點(diǎn),MTH1小分子抑制劑可能對(duì)胃癌有效。在本次研究中,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MTH1抑制劑TH287抑制胃癌細(xì)胞活力及增殖。并且進(jìn)一步研究證實(shí),TH287抑制胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞遷移。MTH1與基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞活力有關(guān),TH287通過(guò)抑制MTH1的功能影響細(xì)胞活力。進(jìn)一步對(duì)TH287作用機(jī)制的研究證實(shí),MTH1抑制劑TH287能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞凋亡。

線粒體是與細(xì)胞死亡有密切關(guān)聯(lián)的細(xì)胞器,線粒體膜電位改變發(fā)生在凋亡早期,并且會(huì)導(dǎo)致包括凋亡相關(guān)分子釋放等一系列反應(yīng)[21,22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TH287治療后,細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生改變,意味著TH287可以誘導(dǎo)線粒體膜電位降低。為了進(jìn)一步證實(shí)TH287是否與細(xì)胞凋亡有關(guān),進(jìn)行了Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示TH287治療BGC-823細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率明顯上升。以往的研究表明,Bax蛋白由細(xì)胞質(zhì)向線粒體外膜轉(zhuǎn)移會(huì)刺激線粒體膜通透性的改變,并且會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞釋放Cyt c[23]。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族成員之一,他們與細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[24]。研究結(jié)果證實(shí)TH287誘導(dǎo)BGC-823凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變,Bcl-2表達(dá)量下降,Bax表達(dá)量上升,Bcl-2/Bax比值下降。此外,有研究表明,Bcl-2/Bax在線粒體中定位決定凋亡的發(fā)生,其比值與凋亡水平有關(guān)[25]。以上研究結(jié)果表明,TH287誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡,可能是通過(guò)線粒體途徑。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞調(diào)控增殖、凋亡、自噬、細(xì)胞周期均有關(guān)[26-30]。此外,多種刺激因子通過(guò)刺激細(xì)胞激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[31]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)典的信號(hào)通路,它調(diào)控細(xì)胞多種生理功能及病理過(guò)程,靶向PI3K/AKT信號(hào)通路的藥物可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們進(jìn)一步研究TH287對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制是否與PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制有關(guān),結(jié)果顯示,TH287處理胃癌細(xì)胞,PI3K表達(dá)水平下降,p-AKT減少,p-AKT/AKT比值下降,證明PI3K/AKT信號(hào)通路被抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AKT磷酸化激活劑SC79[32,33]預(yù)處理后,胃癌細(xì)胞接受TH287治療,細(xì)胞活力和凋亡率發(fā)生部分逆轉(zhuǎn),并且TH287誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的改變也被抑制。這些結(jié)果證明,TH287通過(guò)抑制PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞凋亡,然而更多的證據(jù)還在研究當(dāng)中。

綜上所述,TH287能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖,并且TH287還抑制胃癌細(xì)胞遷移能力。此外,TH287還可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡,影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá),從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而,細(xì)胞信號(hào)通路極其復(fù)雜,TH287對(duì)胃癌細(xì)胞作用是否還影響其他信號(hào)通路及存在更多的潛在作用機(jī)制,目前仍不清楚。不僅如此,MTH1抑制劑TH287作為小分子化合物,目前尚處于研究階段,其毒副作用尚不清楚。盡管如此,研究結(jié)果證實(shí)了TH287具有明顯抗腫瘤作用,提示MTH1抑制劑TH287治療胃癌可能會(huì)是一種新的治療策略。