N6-甲基腺嘌呤與癌癥的研究進展

張玫茵 綜述 婁 閣 審校

表觀遺傳學是研究不涉及核DNA序列變化的可逆和可遺傳的表型變化。這些動態(tài)變化影響著基因表達和蛋白質(zhì)功能等關(guān)鍵的生物學過程。組蛋白甲基化、乙?；⒘姿峄头核鼗苍谡{(diào)節(jié)基因表達和維持染色體結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用[1]。與表觀遺傳DNA修飾類似，研究人員已發(fā)現(xiàn)一百余種類型的RNA修飾[2]，其中，RNA甲基化是RNA修飾的主要形式，這些修飾包括N6-甲基腺嘌呤(m6A)、N7-甲基鳥嘌呤(m7G)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)，其中m6A是一種最常見、含量最豐富的RNA分子內(nèi)部修飾物，它在干細胞的自我更新和分化、mRNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接、核輸出、翻譯、降解和microRNA的加工中發(fā)揮重要作用，而且在一定程度上決定了特定基因的表達或失活，對生長和發(fā)育有著重大影響。因此，目前人們對它的研究十分廣泛。

1 m6A甲基化的基本概念

腺嘌呤第六個原子上的N6-甲基腺嘌呤甲基化，也稱為m6A RNA修飾，是高度保守的，廣泛存在于大多數(shù)真核生物物種(從酵母、植物到哺乳動物)以及病毒mRNA中，并在轉(zhuǎn)錄后的mRNA加工和代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。m6A可動態(tài)改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)mRNA-蛋白質(zhì)相互作用，影響mRNA的選擇性剪接。Chen等[3]人發(fā)現(xiàn)microRNA通過序列匹配機制調(diào)節(jié)METTL3與mRNA的結(jié)合并影響m6A的形成。他們的研究還表明，METTL3的過度表達顯著增加了m6A的水平，進一步增加了小鼠成纖維細胞重編程為多能干細胞的效率。Alarcon等[4]發(fā)現(xiàn)HNRN-PA2B1可以識別并結(jié)合pre-microRNA轉(zhuǎn)錄本上的m6A并參與microRNA的剪接過程。另外，Xiao等[5]已發(fā)現(xiàn)THDC1與SRSF3相互作用以控制mRNA剪接?？傊?，m6A是一種新型的表觀遺傳RNA修飾，它調(diào)節(jié)基因表達，在許多生命過程中至關(guān)重要。

2 m6A與癌癥的關(guān)系

2.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物與癌癥

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物利用S-ad-烯醇甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，甲基化腺嘌呤第6位N中心的氫。METTL3有兩個SAM結(jié)合位點，催化m6A合成。免疫熒光分析顯示，METTL3主要分布在RNA加工的主要部位-核散斑中，說明m6A在RNA加工中起著重要的調(diào)控作用。METTL3在人體組織中含量很高，特別是在睪丸中，并且在多種組織中是保守的。敲減METTL3導(dǎo)致HeLa細胞和HepG2細胞凋亡和m6A水平降低[6]。Liu等[7]報道，METTL14也具有SAM結(jié)合位點，可催化m6A合成。因此，MELLT14被認為是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一個亞基。在m6A合成過程中，METTL14和METTL3以1∶1的比例形成穩(wěn)定的異二聚體，這個異二聚體的特點是酶活性高，底物偏好性強。

METLL3通過與細胞質(zhì)中的翻譯起始復(fù)合物eIF3b相互作用，促進含有大量m6A的致癌基因的mRNA的翻譯。增加METTL3的表達可促進肺癌細胞的增殖、生長和侵襲[8]。2017年，Du等[9]報道METTL3在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達高于癌旁組織。METTL3在NSCLC組織中的表達與miR-33a的表達呈正相關(guān)。miR-33a能夠在mRNA和蛋白水平上降低METTL3的表達，揭示了miRNA調(diào)控METTL3的新機制。Cui等[10]發(fā)現(xiàn)，敲低METTL3或METTL14可明顯增強干細胞的生長和膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自我更新能力，從而促進腫瘤的發(fā)展，而過表達METTL3則有相反效果。m6A在白血病中可能發(fā)揮的作用也得到了明確的證實。Vu和他的團隊在急性髓性白血病(AML)患者中發(fā)現(xiàn)，METTL3在AML細胞和原代白血病細胞中高表達。shRNA敲低METTL3后，AML細胞中m6A水平降低，分化和凋亡顯著增加，克隆形成能力下降。m6A個體核苷酸分辨率交聯(lián)、免疫沉淀(miCLIP)和RNA-seq分析顯示，METTL3提高了靶基因C-MYC和BCL2中mRNA的m6A水平，并通過穩(wěn)定mRNA來增強其翻譯，從而導(dǎo)致靶基因的更高表達，同時使AML細胞保持未分化狀態(tài)[11]。Weng等[12]發(fā)現(xiàn)METTL14的mRNA在正常造血干祖細胞(HSPCs)和包括t(11q23)、t(15；17)和t(8；21)的AML白血病細胞中富集，細胞分化后下調(diào)。敲低METTL14可促進正常HSPCs和AML細胞的分化，但抑制后者的增殖。進一步研究表明，METTL14通過抑制靶基因的表達，維持白血病干細胞起始細胞(LSCS LICs)及其自我更新，并通過調(diào)節(jié)MYB、MYC等靶基因mRNA中m6A的水平促進白血病的發(fā)生。

最近的研究表明[13]，在宮頸癌細胞系SiHa中，通過使用shRNA敲低METTL3/METTL14或過度表達FTO ALKBH5后，m6A水平的降低促進了腫瘤生長。相反，m6A水平升高抑制宮頸癌細胞的生長，因此提示METTL3和METTL14在宮頸癌中的抑癌作用。對腎細胞癌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，METTL3在腎細胞癌患者中的高表達提示預(yù)后良好，這意味著METTL3可能在腎細胞癌的細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著腫瘤抑制基因的作用。METTL3可能通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和PI3K-Akt-mTOR通路發(fā)揮作用[14]。總之，METTL3和METTL14在肺癌和急性髓性白血病中具有致癌作用，在膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌和腎癌中具有腫瘤抑制作用。

2.2 m6A去甲基化酶和癌癥

研究人員發(fā)現(xiàn)脂肪團和肥胖相關(guān)蛋白(Fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)是m6A mRNA去甲基化酶，而且，它的發(fā)現(xiàn)證明了m6A的修飾是動態(tài)的和可逆的。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5能以α-酮戊二酸和鐵依賴的方式催化m6A去甲基化[15]。最近，研究報道了FTO和ALKBH5在許多生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括生物發(fā)育、代謝和繁殖。已知FTO位于細胞核內(nèi)，并與人體體重和體重指數(shù)的增加密切相關(guān)。另一種去甲基化酶ALKBH5在大多數(shù)組織中表達，特別是在睪丸中豐富。像FTO一樣，ALKBH5在核散斑中含量豐富，其損失明顯影響核散斑中的RNA代謝和mRNA組裝。盡管小鼠ALKBH5缺失不影響生長和生理，但由于減數(shù)分裂中期精母細胞的凋亡，生育力受損[15]。據(jù)報道[16]，F(xiàn)TO在MLL重排、FLT3-ITD和/或NPM1突變的AML中高表達，與MLL重排的AML細胞中突變FTO(H231A和D233A)的過表達相比較，只有野生型FTO的過表達促進白血病細胞生長。敲除FTO后，m6A的水平上調(diào)，表明FTO通過調(diào)節(jié)m6A修飾來調(diào)節(jié)這種表型。這種表型也出現(xiàn)在PML-RARA和FLT-ITD NPM1突變的AML中。骨髓移植實驗表明，F(xiàn)TO的過度表達可加速MLL-AF9誘導(dǎo)的白血病發(fā)生。該研究表明，F(xiàn)TO過表達后，由于AML細胞中低甲基化的m6A峰，含SOCS盒2(ASB2)和視黃酸受體-α(RAR α)的mRNA下調(diào)。這兩種蛋白在全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的差異白血病細胞中上調(diào)[17-18]。進一步的研究表明，F(xiàn)TO通過調(diào)控ASB2和RARA的轉(zhuǎn)錄來阻斷逆轉(zhuǎn)的AML細胞分化，從而表明FTO在白血病發(fā)生中的關(guān)鍵致癌作用。

膠質(zhì)母細胞瘤(GSCs)的不良預(yù)后與ALKBH5過表達相關(guān)[20]。ALKBH5的沉默抑制了GSCs的增殖。將m6A IP-seq和GSC的轉(zhuǎn)錄組分析與ALKBH5的敲除整合，篩選出了forkhead box M1(FOXM1)基因，其是ALKBH5的重要靶基因。高表達的FOXM1是細胞周期的關(guān)鍵蛋白，這與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后不良有關(guān)。降低m6A水平增強了人抗原R(HUR)與FOXM1的前體mRNA之間的連接，從增加了FOXM1前體mRNA的穩(wěn)定性，同時進一步證實了FOXM1在GSC腫瘤發(fā)生中起到關(guān)鍵作用[20]。在乳腺癌干細胞(BCSCs)中，缺氧導(dǎo)致ALKBH5高表達，并以HIF-依賴性方式降低m6A水平[21]。這種去甲基化增強了NANOG mRNA的穩(wěn)定性并導(dǎo)致NANOG上調(diào)。雖然ALKBH5的缺乏削弱了由缺氧誘導(dǎo)的BCSC富集，但ALKBH5的過度表達也表明了缺氧。因此，HIF-依賴的ALKBH5的表達有助于BCSC在低氧腫瘤微環(huán)境中的富集。此外，乳腺癌患者的METTL14水平明顯降低，并且與較短的生存時間密切相關(guān)[16]。

2.3 m6A結(jié)合蛋白與癌癥

YTHDF2作為m6A的閱讀器，通過識別和結(jié)合靶RNA的m6A位點影響RNA的穩(wěn)定性。目前，已發(fā)現(xiàn)三種蛋白質(zhì)YTH-DF1/2/3是m6A的結(jié)合蛋白。三者都含有一個相對保守的羧基末端YTH結(jié)構(gòu)域與m6A結(jié)合。YTHDF2選擇性結(jié)合m6A修飾的mRNA，將其募集到mRNA降解位點，控制其穩(wěn)定性，并通過CCR4-NOT介導(dǎo)的去甲基化促進mRNA降解[21]。YTHDF1與翻譯起始因子相互作用以增強靶RNA翻譯[9]。YTHDF3和YTHDF1之間的協(xié)同作用促進翻譯和YTHDF2誘導(dǎo)的mRNA降解[22-23]。因此，這三種蛋白質(zhì)YTHDF1/2/3共同調(diào)節(jié)RNA的代謝。YTH(YT521-B homology)結(jié)構(gòu)域蛋白1(YTH domain containing 1，YTHDC1)是一種調(diào)節(jié)剪接的核m6A結(jié)合蛋白[24-25]。不同的核蛋白A2/B1(HNRNPA2B1)結(jié)合m6A修飾的轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)microRNA(miRNA)在細胞核中的剪接和成熟。此外，m6A還可以抑制RNA的二級結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)m6A鄰近區(qū)域的RNA結(jié)合蛋白的RNA結(jié)合能力。這種機制被稱為m6A開關(guān)，促進HNRNPC和HNRNPG與靶基因的結(jié)合，控制mRNA的豐度和剪接[25-29]。

在婦科腫瘤細胞系中，由于缺氧，YTHDC1蛋白水平的降低改變了RNA剪接。結(jié)果表明，m6A結(jié)合蛋白YTHDF2增強了HIF-1的翻譯并導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤的轉(zhuǎn)移[30-31]。研究表明，癌基因c-Myc促進m6A結(jié)合蛋白YTHDF1在結(jié)直腸癌中的表達，而它的敲除抑制YTHDF1的表達[32]，由此表明，m6A結(jié)合蛋白YTHDF1在結(jié)直腸癌的進展中發(fā)揮重要作用。

3 小結(jié)與展望

最近研究表明，被m6A修飾的蛋白在多種癌癥中發(fā)揮重要的作用。一些m6A相關(guān)蛋白可能對不同類型的癌癥產(chǎn)生相似的影響，而另一些蛋白質(zhì)可能在相似類型的癌癥中發(fā)揮不同的作用。例如，F(xiàn)TO已被證明在白血病和GBM中有致癌作用，相反，ALKBH5在GBM和乳腺癌中起致癌作用，在白血病中起抑癌作用。同樣，METTL3在肺癌中具有腫瘤促進作用，在GBM中具有腫瘤抑制作用。通過調(diào)節(jié)不同的靶基因，m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶可能在不同類型的癌癥中發(fā)揮相似功能。這些m6A修飾的調(diào)控因子可以是癌癥診斷和藥物研發(fā)的新靶點。目前，F(xiàn)TO和ALKBH5的致癌作用已被證實，它們的抑制劑可作為抗癌藥物開發(fā)的候選藥物。這些抑制劑通過調(diào)節(jié)癌細胞中的m6A修飾水平來抑制其生長。盡管這些抑制劑尚未在體內(nèi)和臨床試驗中得到驗證，但它提供了開發(fā)m6A特異性調(diào)節(jié)劑的線索，并為抗癌藥物開發(fā)提供了新的藥理學靶點。因此，我們更要進一步研究由m6A介導(dǎo)的基因在不同類型癌癥中的生物學功能和相關(guān)分子機制，為癌癥的早期診斷和治療提供更多的可能。