新疆喀什地區(qū)維吾爾族群體不同哺乳期母乳中乳桿菌的種群多樣性

李小娟，倪永清*，張 艷*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

隨著人們生活水平的提高和對健康食品需求的增加，乳及其制品在日常飲食中所占比例逐漸增大。尤其是發(fā)酵乳制品既富含營養(yǎng)物質(zhì)，同時又提供了以乳酸菌為主的豐富益生菌，對于改善人體免疫力和提高全民身體素質(zhì)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。乳酸菌是發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類乳酸細菌，除能賦予乳制品細膩的口感、良好的風(fēng)味、特殊的質(zhì)地和更加全面的營養(yǎng)外，研究發(fā)現(xiàn)還具有一定的食療作用[1]。乳桿菌是乳酸菌的主要類群，革蘭氏陽性且無芽孢桿菌，細胞形態(tài)大多為鏈桿狀或球桿狀，耐酸性較強、厭氧或兼性厭氧。它不僅抑制病原菌的入侵和感染、增強機體免疫力、抗腫瘤作用，而且可以預(yù)防和抑制胃腸道腫瘤術(shù)后菌群失調(diào)和細菌移位的發(fā)生等作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌對抗生素引起的腸道菌群失衡也具有一定的調(diào)節(jié)作用[3]。

目前已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌至少有23 個屬[4]，廣泛存在于動物的腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、口腔以及皮膚等[6]。目前母乳中發(fā)現(xiàn)的細菌主要以乳桿菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、乳球菌（Lactococcus）和腸球菌（Enterorococcus）為主，已有描述的119 種乳桿菌中母乳占有25 種，如L. acidophilus、L. bulgari、L. dervis和L. fermentum等[5]。乳酸桿菌的益生特性早有文獻報道[7]，如Olivares等[8]證實了L. gasseri CECT5714不僅能增加病原菌感染實驗小鼠的存活率，而且還具有抗感染的作用。

母乳是嬰兒成長最自然、最安全的天然食物，它含有嬰兒成長所需的所有營養(yǎng)物質(zhì)和抗體，在提供給嬰兒充分營養(yǎng)的同時也使其免疫系統(tǒng)得到最大保障。過去認為母乳中的微生物來源于外源環(huán)境污染[9]，后來研究表明母乳本身就含有活性物質(zhì)，其中，微生物是主要的活性成分，并作為益生菌發(fā)揮作用。而母乳中的益生菌作為首批進入到新生子代胃腸道的微生物，對嬰兒腸道、免疫系統(tǒng)等有著深刻且長久的影響[10]，越來越多的研究證實母乳喂養(yǎng)對于預(yù)防新生兒過敏、感染、營養(yǎng)不良等均具有顯著作用[11-13]，因此關(guān)于母乳微生物群落的相關(guān)研究也成為科學(xué)家關(guān)注的熱點。李思奇等[14]研究發(fā)現(xiàn)母乳乳酸菌和發(fā)酵乳桿菌等能夠定殖于嬰兒腸道，通過促使嬰兒腸道發(fā)育及免疫系統(tǒng)的成熟提高自身對病原菌的抵抗能力；且母乳中的細菌構(gòu)成受泌乳時間的影響。因此，研究不同哺乳期母乳中益生乳桿菌的組成、變化規(guī)律和作用機理至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)無論是腸道菌群還是母乳菌群都與人類生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣和地域性差異等均有密不可分的關(guān)系[15]。新疆以其異域風(fēng)情和文化積累所形成的維吾爾族地域性、飲食文化和生活習(xí)慣等差異，加之維吾爾族婦女的分娩方式以順產(chǎn)為主，這為母乳中乳桿菌的開發(fā)提供了獨特豐富的樣品來源[16]。本實驗研究維吾爾族母乳中乳桿菌的種系組成及其變化，以確定不同哺乳期母乳中乳桿菌的分布規(guī)律和優(yōu)勢菌群及乳桿菌種群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，以期為母乳中益生菌資源的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

45 個母乳樣品來源于新疆喀什地區(qū)的健康婦女。其中，15 個樣品來自伽師縣人民醫(yī)院均為初乳（0～5 d），其余30 個樣品有15 個來自伽師縣克勒魯克鄉(xiāng)，15 個來自伽師縣克孜勒蘇鄉(xiāng)且均為成熟乳（10 d～19 個月）。母乳收集時，健康媽媽佩戴一次性無菌手套，用無菌生理鹽水浸泡的紗布輕輕擦拭乳頭及周圍，隨后小心手動擠出母乳，去掉第1滴，收集約4～5 mL的母乳于無菌離心管中，作好標記和記錄，用封口膜將離心管口密封好并置于4 ℃保藏，12 h內(nèi)運回實驗室后儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（改良版）購自北京博奧拓達科技有限公司，在MRS培養(yǎng)基[17]成分的基礎(chǔ)上添加無菌膜過濾的0.05% L-半胱氨酸。

乳桿菌選擇性培養(yǎng)基購自北京博奧拓達科技有限公司，胰酪蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，磷酸二氫鉀6.0 g/L，檸檬酸銨2.0 g/L，乙酸鈉25.0 g/L，硫酸鎂0.575 g/L，硫酸錳0.12 g/L，亞硫酸鐵0.034 g/L，吐溫80 1.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 5.5±0.2，25 ℃。

0.22 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物上海捷瑞生物有限公司；Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PCR Master Mix、dd H2O 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

相差顯微鏡 上海光密儀器有限公司；厭氧箱（罐） 上海杰涵有限責(zé)任公司；HLR56495超高速控溫離心機 美國Thermo公司；DK-8D水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3D pH酸度計、PCR儀 上海精密科學(xué)有限公司；DOC XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離及純化

將配好的MRS（含半胱氨酸0.5 g/L）和乳桿菌選擇性培養(yǎng)基滅菌后倒平板，凝固后將母乳樣品用無菌水稀釋，在10-3、10-4、10-5梯度的情況下各吸取100 μL于平板中涂布、編號并記錄，于厭氧箱37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h。

每個樣品選擇適宜梯度的平板挑取色澤、大小、形狀均不同的15～20 個單菌落觀察細胞形態(tài)，將細胞形態(tài)呈桿狀或短桿狀的菌落劃線厭氧培養(yǎng)，反復(fù)劃線至同一平板中的菌落顏色、大小、形狀均一致為止。純菌種-20 ℃甘油保藏，長期保存應(yīng)放置于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 DNA的提取

采用十六烷基三乙基溴化銨（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）法對所純化的菌株進行DNA的提取[18]，并進行核酸含量的測定，根據(jù)核酸質(zhì)量濃度的不同可將其分為小于20 ng/μL、20～100 ng/μL和大于1 0 0 n g/μ L三類，在進行多重聚合酶鏈式反應(yīng)（repetitive polymerase chain reaction，rep-PCR）時按照需要取不同量達到相似質(zhì)量（約50 ng）實現(xiàn)粗略的量化，使得構(gòu)建的指紋圖譜帶型為同一亮度。并保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 rep-PCR指紋圖譜分析

以BOXAIR（5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGAC-3’）為引物進行rep-PCR[19]，擴增體系為25 μL：2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，BOX（0.12 μmol/μL）0.5 μL，雙蒸水9.5 μL，模板DNA 3 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，65 ℃延伸16 min（35 個循環(huán)），65 ℃終延伸16 min。PCR產(chǎn)物于1%～1.2%的瓊脂糖凝膠100 V（2.5 V/cm）電泳分析約40 min后通過DOC XR凝膠成像儀上采集照片并記錄，去重后得到帶型完全不同的代表菌株進行測序。

1.3.4 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）引物對代表菌株進行16S rRNA基因擴增[20]。PCR體系為25 μL：2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，10 μmol/L的27F 0.5 μL，10 μmol/L的1492R 0.5 μL，雙蒸水10.5 μL，模板DNA 1.5 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min（35 次循環(huán)），72 ℃終延伸10 min。將3 μL PCR產(chǎn)物點樣于1%凝膠電泳檢測后將剩余的PCR產(chǎn)物作為樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。對所測的16S rRNA基因序列進行BLAST數(shù)據(jù)庫比對，找出與所測序列相似度最高（97%～100%）的BLAST庫的親緣標準菌株，分析樣品中微生物種群的結(jié)構(gòu)及組成后利用Mega Align進行發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表制作

1.4.1 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將比對后的BLAST庫中親緣標準菌株序列與測序菌株序列保存于同一txt文本文件中，導(dǎo)入MEGA Align 5.0進行發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4.2 相對豐度圖

將母乳樣品按照分娩后的時間分為0～5 d（A階段）、5 d～5 個月（B階段）、5～10 個月（C階段）、10～15 個月（D階段）和15～19 個月（E階段）5 個階段，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel并作百分比堆積柱狀圖，以觀察各階段乳桿菌種群的相對豐度。

1.4.3 熱圖及韋恩圖

使用R 3.5.1，載入p h e a t m a p包，使用colorRampPalette()函數(shù)定義漸變顏色向量，繪制熱圖；使用R 3.5.1載入VennDiagram包繪制韋恩圖。

1.4.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

細菌和古菌群落結(jié)構(gòu)的總體變異性用PCA檢驗，其優(yōu)勢在于通過計算PCA模式與環(huán)境約束的對應(yīng)分析排序得分之間的Procrustes平方和，以及在R中嚴格執(zhí)行的Procrustes函數(shù)，檢驗約束模型的擬合優(yōu)度。從而利用分析調(diào)查的結(jié)果推斷不同微生物群落結(jié)構(gòu)的深度和環(huán)境變量的相關(guān)性。通過使用ggplot2包，它提供了兩個功能：ggscreeplotv和ggbiplot。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹

指紋圖譜如圖1所示，以Marker為參照，連續(xù)泳道的相同帶型為一種基因型，以不同基因型的菌株作為代表菌株進行測序。BLAST比對的親緣標準菌株和細胞形態(tài)如表1所示，在97%的相似水平上確定可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)量并歸類，共聚為11 個OTU。發(fā)育樹如圖2所示，測序菌株隸屬于Lactobacillus、Enterococcus和Streptococcus三個屬。其中Lactobacillus有5 個種，K-M66、K-M68、K-M86、K-M75、K-M132和K-M152隸屬于L. brevis，G-M37-2和G-M1-1隸屬L. fermentum，K-M4隸屬L. oris，K-M93隸屬L. vaginalis，K-M90隸屬L. gasseri。

圖1 代表菌株的rep-PCR指紋圖譜Fig. 1 rep-PCR fi ngerprint patterns of representative bacterial strains in 1% agarose

表1 NCBI BLAST比對結(jié)果Table 1 Results of alignment based on NCBI BLAST

圖2 基于16S rRNA測序的菌株系統(tǒng)發(fā)育圖Fig. 2 Phylogenetic tree of strains based on partial 16S rRNA gene sequence

2.2 母乳乳桿菌種群結(jié)構(gòu)多樣性

統(tǒng)計結(jié)果顯示220 株乳桿菌隸屬于5 個種，分別為L. fermentum、L. brevis、L. oris、L. gasseri和L. vaginalis。其中L. fermentum所占比例最大，有82 株，占乳桿菌總數(shù)的37.3%，屬于可培養(yǎng)乳桿菌中的優(yōu)勢菌種。其次分別為L. brevis75 株（34.1%）、L. oris37 株（16.8%）、L. gasseri22 株（10.0%）和L. vaginalis4 株（1.82% ）。如圖3所示，相對豐度較高且在5 個階段均有分布的種群為L. fermentum，L. brevis在成熟乳和晚乳樣中均有分布，且在15～19 個月階段的相對豐度達到最大。不同階段的Lactobacillus種群結(jié)構(gòu)明顯不同，0～5 d初乳的微生物種群結(jié)構(gòu)相對比較單一，只分離得到L. fermentum；5 d～5 個月和5～10 個月階段的成熟乳中乳桿菌種群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，分離得到5 個種的Lactobacillus分別為L. fermentum、L. brevis、L. oris、L. gasseri和L. vaginalis；10～15 個月和15～19 個月的晚乳次之。

圖3 乳桿菌在各階段母乳中的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of Lactobacillus in breast milk samples at various lactation stages

圖4 不同哺乳期母乳中乳桿菌的組成及分布Fig. 4 Composition and distribution of Lactobacillus in breast milk samples at different stages of lactation

如圖4所示，從Heatmap中的顏色梯度和相似程度直觀看出各個階段的母乳樣中Lactobacillus種群結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。按照哺乳期時間的不同將各階段分為：初乳：A階段；成熟乳：B、C階段；晚乳：D、E階段。數(shù)據(jù)顯示B、C階段的乳桿菌種類和數(shù)量居多，其中5 種乳桿菌主要分布于這兩個階段，數(shù)量屬B階段最多。A、D兩階段分離的乳桿菌數(shù)量相對較少。L. fermentum、L. vaginalis和L. oris主要集中于B階段，L. gasseri主要集中于C階段，L. brevis主要集中于E階段。A階段的初乳樣中共分得16 株Lactobacillus且均為L. fermentum，B階段的母乳樣中共分得104 株，有5 個種，分別為L. fermentum44 株、L. brevis25 株、L. oris27 株、L. gasseri5 株和L. vaginalis3 株；C階段的母乳樣共分得40 株，有5 個種，分別為L. fermentum8 株、L. brevis10 株、L. oris7 株、L. gasseri14 株和L. vaginalis1 株；D階段的母乳樣中共分得14 株，有3 個種，分別為L. fermentum4 株、L. brevis7 株和L. oris3 株；E階段的母乳樣中共分得46 株，共3 個種，分別為L. fermentum10 株、L. brevis33 株和L. gasseri3 株。

圖5 各階段母乳乳桿菌種群結(jié)構(gòu)的PCA圖Fig. 5 Principal component analysis of the population structure of Lactobacillus at various stages of lactation

依據(jù)不同階段的母乳樣品乳桿菌菌群結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，進行PCA（圖5），不同階段的母乳樣品聚集在不同的區(qū)域且主要聚集在右側(cè)，但并沒有構(gòu)成明顯獨立的組群，說明各個階段的母乳樣品中分離的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)盡管存在差異但也有一定的相似性。由圖5可知，B階段的各樣品分布比較分散，說明該階段母乳樣品中乳桿菌的種群結(jié)構(gòu)的相似性比較低；D和E階段樣品分離的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)的相似性相對較高；C階段相似性最高。

通過圖6中A、B、C、D、E階段樣品的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)交叉程度可以直觀看出各階段母乳樣中乳桿菌種群的共有菌種和特有菌種。L. fermentum為5 個階段母乳樣中的共有菌種，共82 株，占Lactobacillus總數(shù)的37.3%；占總數(shù)34.1%（75 株）的L. brevis為B、C、D、E四個階段的共有菌種；L. oris為B、C、D階段共有菌種，共37 株（16.8%）；L. gasseri為B、C、E階段的共有菌種，共22 株（10%）；L. vaginalis是B、C階段的共有菌種，共4 株（1.8%）；數(shù)據(jù)顯示各個階段母乳樣品的特有的乳桿菌菌種數(shù)為0。

圖6 各階段母乳樣中乳桿菌種群結(jié)構(gòu)的Venn圖Fig. 6 Venn diagram of lactobacillus population structures in breast milk samples at different stages of lactation

3 討 論

從所有的母乳樣品中分離的229 株乳酸菌菌株隸屬于3 個屬，分別為Lactobacillus、Enterococcus和Streptococcus。在屬水平上主要以Lactobacillusspp.為主，所占總分離物的96%（220 株）；在種水平上L.fermentum屬于可培養(yǎng)乳桿菌中的優(yōu)勢菌種。Soto等[21]也通過MRS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的方法研究發(fā)現(xiàn)L.fermentum為優(yōu)勢菌種。Collado等[22]利用實時PCR方法在母乳樣品中也檢測到Lactobacillusspp.且為優(yōu)勢菌屬，說明本研究分離方法比較可靠。

在不同的哺乳期階段，母乳樣品中乳桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)成熟乳＞初乳＞晚乳的趨勢，其種類呈現(xiàn)成熟乳＞晚乳＞初乳的趨勢，其中成熟乳5 d～5 個月階段的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。研究表明從成熟乳中分離的Lactobacillus菌株數(shù)相對初乳的較多[21]。Solís等[23]也研究發(fā)現(xiàn)成熟乳（10 d～3 個月）中Lactobacillusspp.的分離比例和種類相對初乳（1 d）要多，與本研究結(jié)果高度一致。說明不同哺乳期母乳中乳桿菌結(jié)構(gòu)變化趨勢明顯，這為研究不同哺乳期的乳桿菌種群多樣性做出了貢獻。其原因可能是由于母親分娩后與外界環(huán)境接觸增多由環(huán)境轉(zhuǎn)移而來的Lactobacillus菌種數(shù)增加，也可能是因為不同哺乳期母乳中營養(yǎng)物質(zhì)的不同使成熟乳自身內(nèi)生菌種相比初乳和晚乳要多[14]，具體原因及作用機制有待進一步研究。

值得深究的是，4 株L. vaginalis集中分布于成熟乳樣品中，Soto等[21]從27 個母乳樣品的其中2 個母乳樣品中也分離得到該菌種（數(shù)據(jù)并未顯示樣品階段），但是沒有與之對應(yīng)的種特異性引物擴增，且相關(guān)的研究和報道較少，說明母乳中可培養(yǎng)的L. vaginalis比較罕見。此外，乳桿菌作為天然菌群除在母體口腔以及皮膚有分布外，泌尿生殖系統(tǒng)中也有分布[6]，且有研究表明，在自然分娩的嬰兒胎糞樣品中發(fā)現(xiàn)有L. vaginalis和L. brevis的存在[24]，因此其來源很可能是在分娩過程中由嬰兒從產(chǎn)道攜帶出來再傳遞至母乳，也可能是母親與周圍環(huán)境的接觸過程中由外界環(huán)境轉(zhuǎn)移而來，但是相關(guān)報道比較少，其來源和益生特性還有待進一步研究。

本研究分離的L. fermentum、L. oris和L. gasseri等菌種據(jù)報道具有明顯的益生特性。研究發(fā)現(xiàn)，母乳分離株L. fermentum CECT5716可以提高26～40 歲健康受試者對流感疫苗的敏感性，并減少流感疾病的發(fā)病率[25]。從母乳中分離的L. oris HMI68是一種具有降低膽固醇特性的共生細菌，能在人類胃腸道條件下生存[26]。也有研究表明分離自母乳的L. gasseri CECT5714對成人呼吸系統(tǒng)過敏癥具有明顯的改善作用[27]。且有研究表明L. fermentum、L. salivarius和L. gasseri均可由母乳傳遞并定殖于嬰兒腸道中[28]。且本研究分離培養(yǎng)方法相比Collado等[22]的實時PCR檢測方法的優(yōu)勢在于分離到的所有Lactobacillus都是可培養(yǎng)菌株并可用作后期益生特性的研究。目前，益生菌多用于功能性食品和臨床，且大多數(shù)益生菌都來自動物腸道和嬰幼兒糞便，有關(guān)母乳中益生菌的研究相對較少。因此，要深入研究新疆喀什地區(qū)維吾爾族母乳中益生菌資源和開發(fā)安全可靠的益生菌制劑，后續(xù)研究母乳中乳桿菌的益生特性至關(guān)重要。

4 結(jié) 論

研究顯示，新疆喀什地區(qū)維吾爾族群體母乳中乳桿菌種群組成豐富，不同哺乳期母乳中乳桿菌變化趨勢明顯。L. fermentum為優(yōu)勢菌種，且為初乳、成熟乳和晚乳的共有菌種。成熟乳樣品中分離的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)相對初乳和晚乳復(fù)雜，其中成熟乳5 d～5 個月階段的乳桿菌種群結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，且較罕見的L. vaginalis也主要集中于該階段。表明乳桿菌種群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與不同的哺乳期有著密切聯(lián)系，這為研究新疆喀什地區(qū)維吾爾族群體不同哺乳階段的母乳中乳桿菌種群多樣性的研究做出了貢獻，同時也為乳源益生菌資源的開發(fā)提供了理論依據(jù)。