茶樹產(chǎn)多酚氧化酶內(nèi)生真菌的篩選及其在速溶茶生產(chǎn)中的應用

王曉霞，邵增瑯，唐杏燕，裴少芬，黃鳴，黃葉飛

（南京融點食品科技有限公司速溶茶工程研究中心，江蘇南京 211300）

植物內(nèi)生真菌（Endophytic Fungi）是指生活在植物寄主中并度過全部或近乎全部生活周期，而對寄主植物并不引起明顯病害的真菌[1]。近年來，內(nèi)生真菌由于物種豐富，數(shù)量龐大，且與其它生物之間生態(tài)關(guān)系緊密，成為天然活性物質(zhì)的潛在來源，引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[2]。相對于其它植物內(nèi)生真菌，茶樹內(nèi)生真菌的研究起步相對較晚，一般集中于不同茶樹、不同部位菌種的分離差異和內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選，未見將功能性茶樹內(nèi)生真菌應用于速溶茶生產(chǎn)的報道。茶樹中含有茶多酚、咖啡堿和茶氨酸等多種次生代謝產(chǎn)物，基于內(nèi)生真菌能夠和寄主植物互作的原理，有可能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化這些活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌菌株。

多酚氧化酶是茶樹中普遍存在的一種酶，是紅茶加工中品質(zhì)形成的關(guān)鍵酶類，可催化氧化兒茶素類物質(zhì)形成茶黃素、茶紅素類色素，對紅茶色、香、味等品質(zhì)的形成具有關(guān)鍵作用[3]。多酚氧化酶在速溶紅茶加工中的重要作用受到廣泛關(guān)注和研究。

近些年，隨著冰紅茶飲料的迅猛發(fā)展，大大增加了速溶紅茶的需求量。由于常規(guī)速溶紅茶生產(chǎn)必須以紅茶作為提取原料，而當前紅茶原料供需矛盾突出，但低檔綠茶和烏龍茶原料供應充分，于是很多速溶茶生產(chǎn)企業(yè)以綠茶或烏龍茶為原料，通過堿轉(zhuǎn)溶法制備速溶紅茶，但是堿轉(zhuǎn)溶速溶紅茶存在茶湯湯色深暗、轉(zhuǎn)溶氣味濃、口感單薄等問題，用在冰茶中勉強可用，在奶茶類產(chǎn)品中則無法滿足優(yōu)質(zhì)奶茶湯色粉紅或黃紅明亮、口感濃醇爽滑的品質(zhì)要求[4]。研究就目前速溶茶生產(chǎn)中存在的堿轉(zhuǎn)溶速溶紅茶品質(zhì)差等問題，從茶樹內(nèi)生真菌中篩選出產(chǎn)多酚氧化酶的內(nèi)生真菌菌株，并將其應用于速溶茶的生產(chǎn)工藝中，初步探討產(chǎn)多酚氧化酶內(nèi)生真菌在速溶茶生產(chǎn)中的應用效果和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可能性，為功能性茶樹內(nèi)生真菌的開發(fā)和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

提取用的綠碎茶原料購自黃山一品有機茶葉有限公司；內(nèi)生真菌菌株篩選自江蘇省南京市紫金山中山陵茶廠中種植了十年的 “龍井長葉”茶樹。

茶多酚購自大閩食品（漳州）有限公司。

1.2 儀器設備

LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 （太倉市實驗設備廠）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHG-9003BS電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TU-1810DS紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SW-CJ-ID型雙人凈化工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）；2100N臺式濁度儀（哈希公司）；Lovibond PFX195比色計 （深圳鼎鴻運貿(mào)易科技發(fā)展有限公司）；PHS-25型數(shù)顯pH計 （上海儀電科學儀器股份有限公司）；TDL-5-A型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SPD-1SC高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理（中國）有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0 g煮沸30 min，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.7 g，蒸餾水100 mL；121℃滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮沸30 min，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1000 mL；121℃滅菌20 min。

茶多酚液體培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶多酚固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶水發(fā)酵培養(yǎng)基：綠碎茶100.0 g，水1300 mL，93℃浸提 30 min，紗布過濾去除茶渣；121℃滅菌 20 min。

1.3.2 內(nèi)生菌的篩選

參考陳煙蘭等[5]的方法，在茶園中隨機采集直徑為0.5 mm以上的健康茶樹枝條。將采回的樣本葉片摘下，用75%酒精浸泡30 s，再用無菌水漂洗，自然晾干后用于內(nèi)生真菌的分離、培養(yǎng)。從每一葉片中用無菌解剖刀在距葉柄約1/3處沿主脈切開，切取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，經(jīng)表面消毒后，在裝有50 mL茶多酚液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、180 r/min條件下富集培養(yǎng)耐茶多酚的茶樹內(nèi)生真菌，每一個三角瓶各放入茶葉組織塊5個。培養(yǎng)一定時間后將茶葉組織塊上出現(xiàn)的真菌菌絲分別移接到PDA培養(yǎng)基上，進行純化、編號保存。菌種用甘油管低溫保藏。

1.3.3 內(nèi)生菌在速溶紅茶生產(chǎn)中的應用

將篩選出的產(chǎn)多酚氧化酶較強菌株制成菌懸液，以相同接種量單獨或混合接種到茶多酚液體培養(yǎng)基中，測定菌株生長情況；將生長旺盛的菌株接種到茶水發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，每隔1 d取發(fā)酵液，將發(fā)酵液用8層紗布過濾、濃縮、滅菌、噴干后觀察湯色、測定色度、茶多酚含量及其它相關(guān)指標。

1.3.4 測定方法

生長曲線測定。菌體生長量使用分光光度法測定[6]，在波長600 nm處測定吸光值，用OD600表示，圖表中OD600值均為菌體發(fā)酵液吸光值減去不接菌培養(yǎng)基吸光值。

茶粉湯色變化。對茶粉湯色變化進行拍照，并用色度儀測定色度值L*、a*、b*值的變化。

理化指標測定。噴干茶粉中茶多酚含量采用GB/T 8313—2018[7]中的HPLC法測定，咖啡堿采用GB/T 8312—2013[8]中的紫外分光光度法測定；pH和濁度分別采用數(shù)顯pH計和臺式濁度儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理，通過ANOVA方式，采用Duncan’s multiple range tests對不同處理之間的差異性在p＜0.05及p＜0.01水平上進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的篩選

通過PDA培養(yǎng)基初篩和茶多酚固體培養(yǎng)基復篩，從茶樹葉片組織中分離得到了5株能在茶多酚培養(yǎng)基中較強較快產(chǎn)生紅褐色氧化圈的菌株， 分別命名為 EC-1、EC-2、EC-3、EC-4 和 EC-5，如圖 1。

將這5株菌轉(zhuǎn)接到茶多酚液體培養(yǎng)基中，測定其生產(chǎn)情況。從圖2（A）可以看出，這5株菌均能較好地在茶多酚液體培養(yǎng)基中生長，它們在茶多酚液體培養(yǎng)基中的延滯期均較短，其中EC-1發(fā)酵培養(yǎng)3天后開始進入衰亡期，其生長量也較其它菌株少，EC-2和EC-5生長量接近，EC-5略低。菌株EC-4在茶多酚培養(yǎng)基中生長最好，其發(fā)酵液變色也最明顯，說明其產(chǎn)多酚氧化酶的能力最強[9]，EC-3生長也很好。

將在茶多酚液體培養(yǎng)基中生長最好的兩株菌EC-3和EC-4分別單獨和1∶1混合轉(zhuǎn)接到新的茶多酚液體培養(yǎng)基中，測定其生長情況。從圖2（B）可知，EC-3和EC-4在茶多酚培養(yǎng)基中的延滯期非常短，說明這兩株菌已經(jīng)完全適應了茶多酚培養(yǎng)基的營養(yǎng)環(huán)境，其中EC-3較EC-4早進入生長穩(wěn)定期，也早進入衰亡期，EC-4比EC-3生長地更好；而EC-3和EC-4混合發(fā)酵，其生長要比兩者單獨發(fā)酵更好，可能是混合培養(yǎng)時兩菌之間發(fā)生直接或間接的相互作用，互相提供所需的營養(yǎng)，轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物，或通過一些物理或生化機制刺激彼此間的生理活性[10]。因此，選擇EC-3和EC-4混合菌發(fā)酵綠茶浸提液制備速溶紅茶更適宜。

2.2 EC-3和EC-4混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶

用 EC-3 和 EC-4 混合菌懸液（1∶1）按 6%接種量混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶，技術(shù)路線如圖3所示。噴干后茶粉湯色變化如圖4所示，理化指標如表1所示。從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，茶水湯色越來越接近紅茶特有的品質(zhì)，在發(fā)酵第3 d的時候，茶水湯色紅艷明亮，金圈厚亮，香氣清爽純正、濃郁持久，滋味醇厚，具有紅茶特有的風味。說明EC-3和EC-4混合菌能夠很好地利用綠茶提取液進行發(fā)酵，產(chǎn)生多酚氧化酶，將茶水中的兒茶素類物質(zhì)氧化成茶黃素、茶紅素和其他氧化聚合物[11]。另外，氧化3 d的茶湯金圈飽滿厚亮，說明紅茶特征性指標茶黃素[4]含量較高；發(fā)酵第4 d的湯色紅艷，金圈減少，說明此時茶湯中茶紅素含量過高，氧化過度，故用EC-3和EC-4混合發(fā)酵3 d最為適宜。

從表1可知，隨著發(fā)酵時間的進行，茶湯中茶多酚、咖啡堿以及色度值中的L*、a*值變化顯著（p＜0.01），茶多酚含量明顯減少，咖啡堿含量也逐漸減少；色度值中L*逐漸增大，說明混合菌還具有澄清茶湯的作用，可能是混合菌發(fā)酵不僅會產(chǎn)生多酚氧化酶，還會產(chǎn)生少量的其它酶類，比如產(chǎn)生單寧酶，使茶湯逐漸變得透亮；a*和b*值逐漸增大，說明茶湯逐漸變紅變黃，這和感官看到的湯色變化一致。茶湯的濁度也逐漸減少，這和L*變化應該是一樣的原因；發(fā)酵過程中茶湯的pH逐漸增大，根據(jù)微生物的生長特點，一般發(fā)酵液的pH應該是先降低后升高[12]，而試驗中發(fā)酵液pH逐漸增大，這可能跟測定時間有關(guān)，從上面的試驗結(jié)果可以知道，菌株EC-3和EC-4延滯期較短，當發(fā)酵液中的碳源利用完后，菌體相對較多地利用氮源，導致發(fā)酵液pH值上升[13]。

圖1 株菌在茶多酚固體培養(yǎng)基上的顏色反應Fig.1 The color reaction of fungi on the tea polyphenols solid medium

圖2 株菌在茶多酚液體培養(yǎng)基中的生長情況Fig.2 The growth curve of the fungi on the tea polyphenols liquid medium

圖3 內(nèi)生菌制備速溶紅茶的技術(shù)路線Fig.3 Technical roadmap for preparation of instant black tea by endophytic fungi

圖4 速溶紅茶粉湯色隨發(fā)酵時間的變化Fig.4 Change of the liquor color of instant black tea with fermentation time

表1 速溶紅茶粉理化指標隨發(fā)酵時間的變化Table 1 Change of chemical compontents of instant black tea powder with fermentation time

3 討論

近年來，對茶樹內(nèi)生真菌的研究得到了快速發(fā)展，但在研究程度上存在“初步研究多，深入研究和應用少”的特點[14]，研究的質(zhì)量、應用面、實用性提升的空間依然很大。茶葉中含有多種天然活性物質(zhì)，是生物轉(zhuǎn)化先導化合物的資源寶庫[14]，目前研究較多的依然是茶多酚的生物轉(zhuǎn)化，其他成分的生物轉(zhuǎn)化研究較少，后續(xù)有必要進一步擴大研究面，為茶樹功能性成分的開發(fā)利用打下基礎。

文章通過在茶多酚培養(yǎng)基中顯色的方法[15]，從茶樹葉片組織中分離得到了5株產(chǎn)多酚氧化酶的菌株，說明這些真菌可以利用茶多酚作為營養(yǎng)而生長。這些產(chǎn)多酚氧化酶的菌株中，以EC-3和EC-4混合發(fā)酵效果最好，說明其分泌酶的能力最高；通過EC-3和EC-4混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶的效果可知，從茶樹中分離得到的產(chǎn)多酚氧化酶的菌株能實現(xiàn)綠茶提取液氧化制備速溶紅茶，且氧化效果可觀，這一研究結(jié)論對茶葉深加工行業(yè)是一大突破，同時也為茶葉深加工產(chǎn)品提供了新的開發(fā)方向。研究雖通過鑒別培養(yǎng)基平板篩選的方法獲得了目標菌株，將其應用于速溶茶的生產(chǎn)得到了理想的效果，但并未對篩選的菌株作生物學鑒定，還需進行后續(xù)工作。另外，考慮到微生物酶系成分復雜，種類多[16]，因此對產(chǎn)生的氧化酶的性質(zhì)還有待進一步的酶學分析[17]。