Bacillus flexus β-淀粉酶低pH 值突變體的構(gòu)建及在麥芽糖制備中的應(yīng)用

亓旭輝，吳 敬，王 蕾，陳 晟*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

β-淀粉酶（β-amylase）又名麥芽糖苷酶、糖原淀粉酶，系統(tǒng)名為α-1，4-葡聚糖-4-麥芽糖水解酶（α-1，4-Dglucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2）。β-淀粉酶作用于淀粉時(shí)，能夠從其非還原性末端依次切下麥芽糖，獲得的產(chǎn)物為：β-麥芽糖、β-極限糊精及非常少量的β-葡萄糖[1]。因此β-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品加工、釀造、淀粉糖制備以及醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，還可通過與其他淀粉水解酶如普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等復(fù)配，應(yīng)用于高純度麥芽糖漿的生產(chǎn)。

β-淀粉酶首先被發(fā)現(xiàn)存在于高等植物中，如大豆，麥芽，大麥，馬鈴薯，玉米等[2]。目前商品化的β-淀粉酶主要來源于大麥、大豆、甘薯等糧食作物。由于植物提取β-淀粉酶存在糧食消耗量大、純度較低、質(zhì)量不穩(wěn)定、廢水量大等缺點(diǎn)，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-淀粉酶已成為研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)[3]率先從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌β-淀粉酶后，陸續(xù)又有多種產(chǎn)β-淀粉酶的微生物菌株被發(fā)現(xiàn)，包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[4-5]，多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）[2]，環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）[6]、熱硫梭菌（Clostridium thermosulfurogenes）[7]等。與植物β-淀粉酶相比，微生物來源的β-淀粉酶具有生產(chǎn)工藝簡單、不受原料限制、質(zhì)量穩(wěn)定、純度高、能水解生淀粉等優(yōu)勢，同時(shí)也更容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、連續(xù)化的生產(chǎn)[8]。

但是目前已報(bào)道的微生物β-淀粉酶最適作用pH 多為6.0～8.0，這一pH 作用范圍與常用的商品化普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等其他淀粉水解酶作用的最適pH 4.5～5.5 存在著很大的差距，難以適用于麥芽糖漿的工業(yè)生產(chǎn)[9-10]。本研究前期從土壤中篩選得到一株產(chǎn)β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus），并將β-淀粉酶基因克隆，構(gòu)建了重組表達(dá)β-淀粉酶的短小芽孢桿菌。前期研究中發(fā)現(xiàn)此重組β-淀粉酶具有比活高，催化效果理想，表達(dá)量高的特點(diǎn)。但是此重組酶最適pH 為7.0，這一pH 條件并不適用于工業(yè)應(yīng)用，因此本研究將對其進(jìn)行定點(diǎn)突變以降低其作用的最適pH 值。突變結(jié)束后選取取得預(yù)期改變的突變體，進(jìn)一步探究其在制備麥芽糖漿中的應(yīng)用效果。以馬鈴薯淀粉為底物，α-淀粉酶進(jìn)行液化之后，用β-淀粉酶與普魯蘭酶復(fù)配生產(chǎn)麥芽糖，并對β-淀粉酶的加酶量進(jìn)行優(yōu)化，以在獲得高效生產(chǎn)麥芽糖漿的工藝的同時(shí)，降低其生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

用于重組質(zhì)粒構(gòu)建的克隆宿主E.coli JM109購于寶生物工程有限公司；表達(dá)宿主Bacillus choshinensis，帶有源自于B.flexus β-淀粉酶基因β-amy 的重組短小芽孢桿菌B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5 g/L。

TM 培養(yǎng)基：多聚蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉10，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0，MnSO4·4H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.5，CaCl22.0，葡萄糖（單獨(dú)滅菌）10 g/L。

1.3 酶和試劑

試劑：DNA 聚合酶以及限制性內(nèi)切酶購自于寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖、核酸電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)品以及其他配套產(chǎn)品購自于上海科晴生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收、PCR 純化以及質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；氨芐霉素（Amp）和新霉素（Neo）購自于生工生物工程（上海）股份有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)（上海）有限公司。高溫酸性α-淀粉酶、普魯蘭酶購自于諾維信公司；麥芽糖購自阿拉丁試劑有限公司。其他試劑（除特殊說明外）均購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 突變體引物的設(shè)計(jì)及載體的構(gòu)建

基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來選擇突變位點(diǎn)，以質(zhì)粒pNCMO2-β-amy 為模板，設(shè)計(jì)PCR 引物（表1），采用一步PCR 法對β-淀粉酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。

表1 β-淀粉酶定點(diǎn)突變用引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis of βamylase

表1 中帶有下劃線的堿基為突變位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 34.3 μL，5×PS Buffer 10 μL，dNTP mixture 4 μL，質(zhì)粒DNA 模板0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，PrimerStar?HS DNA聚合酶0.5 μL。PCR 程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，7 min 40 s；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保溫。

將經(jīng)過Dpn I 處理的PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli JM109 中并涂布到含30 μg/mL Amp 的LB 固體瓊脂平板上。置于37 ℃的條件下培養(yǎng)約8～10 h。從中挑取乳白色、邊緣光滑的單克隆體，接種到含有30 μg/mL Amp 的LB 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃搖床中培養(yǎng)8～10 h 后抽提質(zhì)粒。將獲得的突變質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后進(jìn)一步送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證正確的突變質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主B.choshinensis 中，從而得到含有突變基因的重組基因工程菌。

1.5 突變體的表達(dá)、純化及SDS-PAGE 電泳分析

驗(yàn)證正確的突變菌株以1∶1 的比例保存在30%的甘油管中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)取10 μL 轉(zhuǎn)接到含有10 μg/mL Neo 的10 mL TM 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，然后以5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有10 μg/mL Neo 的50 mL TM 培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)搖瓶發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，即可獲得重組β-淀粉酶的粗酶液。

利用凝膠柱Superdex 200 10/300 GL 進(jìn)行突變體蛋白的分離純化，這一過程是通過雜蛋白與目的蛋白的大小不同而進(jìn)行的分離純化，純化后的突變體蛋白將用于進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)分析。

對粗酶液和純化后的蛋白分別進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，蛋白電泳膠制備及后續(xù)詳細(xì)步驟參考碧云天蛋白電泳試劑盒的說明來進(jìn)行。

1.6 β-淀粉酶活力的測定

用pH 5.5 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）配制2%的可溶性淀粉溶液作為反應(yīng)底物。分別吸取500 μL 底物和400 μL 緩沖液加入到潔凈的15 mL 具塞試管中，置于60 ℃水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱，10 min 后加入100 μL 稀釋后的酶液并混勻，反應(yīng)10 min 后加入800 μL DNS 終止反應(yīng)，沸水浴5 min 顯色并定容到15 mL，在540 nm 波長下測量吸光值。使用沸水中滅活的酶液做空白對照。

酶活單位定義：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 麥芽糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位[2]。

1.7 突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析

對突變體酶的最適作用pH 和作用溫度分別進(jìn)行探究已驗(yàn)證突變效果。將酶液分別用pH 3～8 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）進(jìn)行稀釋。以2%可溶性淀粉作為底物，在50 ℃水浴鍋中分別測定突變體在不同pH 下的酶活，將最高酶活力定義為100%，計(jì)算突變體在不同pH 下的相對酶活。

以2%可溶性淀粉為底物，控制反應(yīng)體系pH 值為突變體各自最適pH 值，并在30～70 ℃溫度范圍內(nèi)設(shè)立不同梯度分別測定重組β-淀粉酶酶活，以確定各突變體最適反應(yīng)溫度。定義最高酶活力為100%，計(jì)算不同溫度下的測得的相對酶活。

1.8 突變體的應(yīng)用

1.8.1 突變體和野生型的應(yīng)用對比及優(yōu)化 配制濃度為10%（w/v）的馬鈴薯淀粉溶液，以12 U/g 底物的量加入α-淀粉酶進(jìn)行液化，保持淀粉溶液溫度90 ℃左右，快速攪拌5～6 min，至淀粉溶液完全澄清。液化結(jié)束后用氫氧化鈉和稀鹽酸調(diào)節(jié)液化液pH 至5.5，分裝至具塞三角瓶中，然后分別加入一定量的普魯蘭酶和β-淀粉酶，這一過程中注意對液化液的保溫以防止其老化。將具塞三角瓶置于60℃水浴搖床中，150 r/min 反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后煮沸樣品以終止反應(yīng)，按1∶1 的比例加入乙腈，靜置1～2 h 使長鏈糖沉淀，離心取上清，產(chǎn)物用HPLC 進(jìn)行檢測。

1.8.2 淀粉水解產(chǎn)物測定方法 β-淀粉酶水解淀粉的產(chǎn)物主要是麥芽糖，同時(shí)含有葡萄糖以及麥芽三糖等副產(chǎn)物，各種產(chǎn)物含量采用HPLC 檢測[11]。色譜條件為：安捷倫1260 HPLC 色譜儀，安捷倫自動進(jìn)樣器，色譜柱Agilent ZORBAX NH2（4.6×250 mm），示差檢測器為安捷倫G1362A；流動相采用68%（v/v）乙腈和蒸餾水的混合溶液，流速設(shè)定為0.8 mL/min，柱溫設(shè)為35 ℃。

1.8.3 麥芽糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

式中：Y 為麥芽糖轉(zhuǎn)化率，%；M 為產(chǎn)物中麥芽糖的質(zhì)量，g；S為底物淀粉的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變體的構(gòu)建

利用在線同源模擬網(wǎng)站SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對重組β-淀粉酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬，選取晶體結(jié)構(gòu)已被解析并且氨基酸序列相似度最高的β-淀粉酶為模板進(jìn)行模擬。同源搜索比對發(fā)現(xiàn)來自B.cereus 的β-淀粉酶（BCB）（PDB 登錄號：1VEO.1.A）的氨基酸序列同源性較高（72.04%），因此選取BCB 作為模板酶進(jìn)行同源建模，模擬結(jié)構(gòu)和模版QMEAN 為-0.81[12]。根據(jù)重組B.cereus β-淀粉酶三級結(jié)構(gòu)確定其Domain A 或Domain A 和Domain B 之間交界的狹縫及功能域Domain B 內(nèi)的Loop 區(qū)。在此基礎(chǔ)上根據(jù)序列信息及三級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果，找到B.flexus 的β-淀粉酶位于淀粉酶Domain A 以及Domain A 和Domain B 之間交界的催化槽及催化關(guān)鍵氨基酸：作為親核試劑的E367及作為酸堿試劑的E172[13]。根據(jù)序列及空間結(jié)構(gòu)信息比對圍繞在親核試劑的E367 周圍氨基酸性質(zhì)如帶電荷、側(cè)鏈基團(tuán)大小、與其他氨基酸形成氫鍵的數(shù)量等進(jìn)行分析，選定擬突變的氨基酸位點(diǎn)以及突變成的目標(biāo)氨基酸。通常在糖苷酶的作為親核試劑的催化關(guān)鍵氨基酸附近引入堿性氨基酸通常可降低反應(yīng)的最適pH[14-15]。選定47、164 和396 號位進(jìn)行定點(diǎn)突變，引入堿性氨基酸K，以期獲得最適pH降低的突變體。

以B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 質(zhì)粒為模板經(jīng)過PCR 獲得含突變位點(diǎn)的目的片段，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，抗性篩選后得到陽性轉(zhuǎn)化子，并測序驗(yàn)證，突變正確的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入B.choshinensis感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證成功后即得目標(biāo)突變體，突變體在甘油管中-80 ℃保藏備用。

2.2 突變體的表達(dá)與純化

將突變體接種到TM 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10-12 h 后按5%的接種量再次轉(zhuǎn)接到TM 培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)搖瓶發(fā)酵48 h。結(jié)束后離心取上清，即可獲得粗酶液。SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖1 所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三個(gè)突變體發(fā)酵上清在57.6 kD 處都有可觀的目的蛋白條帶，其大小與理論的β-淀粉酶分子量相符合，表明β-淀粉酶在B.choshinensis中成功表達(dá)。將粗酶液通過凝膠柱Superdex 200 10/300 GL 進(jìn)行蛋白純化，獲得電泳純蛋白（圖1），用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of mutants

2.3 突變體酶學(xué)性質(zhì)分析

在60 ℃，pH5.5 的條件下測得野生型與突變體的 T47K，Y164K，L396K比活力分別為208.2，93.3，425.7 U/mg，是野生型的33.3%，14.9%，68.1 %。

將酶液分別用pH 3～8 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）稀釋至一定倍數(shù)。以2%可溶性淀粉作為底物，底物與緩沖液混合后在50 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，然后分別在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定這些突變體在不同pH 條件下的酶活。以酶活最高者為100%計(jì)算，算出相對酶活，結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個(gè)突變體均取得預(yù)期改變，最適pH 值均有降低，由野生型的7.0 分別降為6.0、4.5、5.5。此外也印證了Y164 位點(diǎn)對pH 影響的文獻(xiàn)報(bào)道[16]。

圖2 p H 對野生型及突變體酶活的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme acitivity of the wild-type and mutants

在突變體最適的pH 條件下，分別將稀釋一定倍數(shù)的突變體酶液與2%的淀粉溶液相混合，然后分別在35，40，45，50，55，60 ℃以及65 ℃的水浴鍋中保溫10 min。在標(biāo)準(zhǔn)條件下分別測定突變體在不同反應(yīng)溫度下的酶活。以酶活力最高者為100%計(jì)算出其他的相對活力，結(jié)果如圖3 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個(gè)突變體的最適反應(yīng)溫度有較大的變化，分別為55，45，60 ℃。

圖3 溫度對野生型及突變體酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on enzyme acitivity of the wild-type and mutants

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個(gè)突變體的最適pH 值均有降低，與此同時(shí)，最適反應(yīng)溫度也有所變化，相對于野生型最適溫度50 ℃來說，Y164K 最適溫度降低到45 ℃，不利于應(yīng)用于麥芽糖的生產(chǎn)。而L396K 突變體最適pH 降低到5.5，滿足了高純度麥芽糖漿生產(chǎn)中常用以復(fù)配的普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等淀粉酶作用條件。同時(shí)，該突變體最適溫度升高為60 ℃，在麥芽糖生產(chǎn)的過程中，反應(yīng)溫度的提高能夠更好的避免反應(yīng)過程中產(chǎn)生雜菌，同時(shí)，普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等同樣適用于這一溫度[10，17]，因此這一性質(zhì)的改變更適于麥芽糖的工業(yè)生產(chǎn)，我們將對這一突變體的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步探究。

2.4 β-淀粉酶加量對麥芽糖產(chǎn)率的影響

為了初步探究在實(shí)際生產(chǎn)中突變體L396K 和野生型的應(yīng)用效果，配制10%（w/v）的馬鈴薯淀粉溶液，以12 U/g 淀粉的量加入α-淀粉酶液化至澄清。液化結(jié)束后分別加入4 U/g 淀粉的普魯蘭酶以及不同濃度的β-淀粉酶，這一過程中注意保溫防止液化液冷卻老化，然后在pH5.5，60 ℃的條件下進(jìn)行糖化反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，當(dāng)加酶量在10～100 U/g淀粉之間時(shí)，L396K β-淀粉酶糖化的一組麥芽糖產(chǎn)率要明顯高于突變前野生型β-淀粉酶，當(dāng)突變體加酶量為100 U/g 淀粉時(shí)，麥芽糖轉(zhuǎn)化率基本恒定，為80.2%，此最高值相對于突變前的最高值77.5%高2%～3%。同時(shí)，這一麥芽糖含量滿足高純度麥芽糖漿的標(biāo)準(zhǔn)[18]。

圖4 野生型和突變體加酶量對麥芽糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Relationship between β-amylase enzyme dosage and maltose yield

3 結(jié)語

以重組短小芽孢桿菌 B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 菌株為基礎(chǔ)，對B.flexus 來源的β-淀粉酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，并對突變體進(jìn)行酶學(xué)定性。選擇其中性質(zhì)優(yōu)良的突變體L396K 對其制備麥芽糖的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在pH 5.5，60 ℃的條件下，β-淀粉酶加酶量為100 U/g 淀粉時(shí)達(dá)到麥芽糖產(chǎn)率的最大值，為80.2%，此麥芽糖含量滿足高純度麥芽糖漿的標(biāo)準(zhǔn)。這一結(jié)果表明該細(xì)菌來源的β-淀粉酶滿足工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的要求，而且相對于植物來源的β-淀粉酶，該細(xì)菌來源的β-淀粉酶具有生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低，純度高等優(yōu)點(diǎn)，具有很大的應(yīng)用前景。