rDNA 介導(dǎo)的乳酸克魯維酵母整合型表達載體的構(gòu)建及初步驗證

孫海燁，張 梁*，2，李由然，顧正華，丁重陽，2，石貴陽，2

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）能以乳酸為唯一碳源和能源，具有營養(yǎng)要求簡單、生長速率快、分泌蛋白能力強、不會對蛋白高度糖基化、不產(chǎn)生內(nèi)毒素等優(yōu)點[1]，作為美國FDA（Food and Drug Administration）認(rèn)定的食品安全級酵母菌，到目前為止，已有上百種蛋白在該酵母中成功表達并實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，涉及食品、生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。K.lactis外源基因表達的載體主要包括游離型和整合型兩類，前者如pKD1、pKRAS，拷貝數(shù)高但在無選擇壓力條件下易丟失，后者主要為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的載體pKLAC1，穩(wěn)定性高，但拷貝數(shù)相對較低且只能滿足單個基因的整合表達[3-4]。此外，K.lactis 在外源蛋白分泌表達中仍存在瓶頸，其蛋白產(chǎn)量還有很大的提升空間。隨著生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酵母表達系統(tǒng)得到相應(yīng)的發(fā)展，Dujon 等于2004 年完成K.lactis 的全基因組測序[5]，有利于深入掌握該菌株的遺傳信息并進行合理改造。研究者主要通過增加外源基因的劑量或共表達分泌途徑中的輔助因子、分子伴侶等方式來提高外源蛋白的產(chǎn)量，而目前表達載體的選擇較為局限，因此亟待構(gòu)建合適的分子工具滿足工業(yè)化的不同需求。

核糖體DNA（rDNA）是細(xì)胞核中編碼核糖體RNA（rRNA）的脫氧核苷酸序列，由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成，具有高度保守性，以重復(fù)單元存在于真核生物基因組中[6]。以rDNA 為同源重組位點構(gòu)建表達載體，在無選擇壓力條件下可以實現(xiàn)單個目的基因多拷貝或多個目的基因單拷貝穩(wěn)定整合于基因組中[7-8]，通過增加外源基因拷貝數(shù)或共表達輔助因子從而實現(xiàn)外源蛋白高效分泌表達的目的[9]，且對宿主菌無不良影響[10]，該策略已成功應(yīng)用于釀酒酵母（Sacchormyces cerevisiae）[11-12]、畢赤酵母（Pichia pastoris）[9]、K.lactis[13-15]、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）[16]、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）[17-18]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[19]、法夫酵母（Phaffia rhodozyma）[20]、Arxula adeninivorans[21-22]和產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）[23]等酵母菌的異源表達。研究發(fā)現(xiàn)，整合位點在rDNA 單元中的位置、性質(zhì)，表達盒的大小以及篩選標(biāo)記的選擇對整合效率和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[6，11，14，18-19]，從單拷貝到多達數(shù)十個拷貝均有報道，表明整合位點的選擇導(dǎo)致宿主菌種基因拷貝數(shù)的差異。K.lactis 基因組中rDNA 有68 個重復(fù)單元，每個單元長度為8.6 kb 左右，由5S、26S、18S、基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS）和外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS）組成[14，24]。目前，在K.lactis 中利用rDNA 介導(dǎo)同源重組尚處于初步階段，研究發(fā)現(xiàn)因選取rDNA 單元中不同位置的同源整合序列，重組菌的整合拷貝數(shù)有很大差異，少則幾個，多則達到120 個[13-15]?，F(xiàn)階段，對于rDNA 重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)、重要元件的作用以及分子重組機制等缺乏系統(tǒng)認(rèn)識，需要進一步深入研究。

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase，EC 3.5.4.6）是一種氨基水解酶，催化腺苷酸脫去氨基產(chǎn)生肌苷酸和NH3，在嘌呤代謝循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，維持機體免疫力和腺苷酸能荷，作為工業(yè)生產(chǎn)中重要的酶已廣泛用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[25]。基于該酶穩(wěn)定性高、易于定量檢測的優(yōu)點，以AMPD 為報告基因，并以實驗室前期研究中的強啟動子pScGAL7 為外源基因表達的調(diào)控元件，構(gòu)建18S rDNA 介導(dǎo)的整合型表達載體pTRGA-amdS，利用RT-QPCR 測定重組菌外源基因的整合拷貝數(shù)[26]，初步探究拷貝數(shù)與AMP 脫氨酶酶活的關(guān)系，并測定重組載體的穩(wěn)定性，為進一步研究rDNA 單元在K.lactis 基因工程中的應(yīng)用作了初步嘗試，對具有廣闊應(yīng)用前景的K.lactis 進一步分子改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 文中所用質(zhì)粒和菌株見表1。

表1 本研究中所使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 引物 根據(jù)基因序列設(shè)計PCR 特異性引物（表2），委托金唯智公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基添加20 g/L 瓊脂粉，添加終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素用于E.coli轉(zhuǎn)化子的篩選；YEPD 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖20.0，用于K.lactis、S.cerevisiae的培養(yǎng)；YEPDG 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖10.0，半乳糖10.0；YEPG 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，半乳糖20.0；YCB 固體培養(yǎng)基（g/L）[26]：酵母基礎(chǔ)碳源11.7，1 mol/L pH 7.0 的KH2PO4-K2HPO4緩沖液30 mL/L（終濃度30 mmol/L），瓊脂粉20，滅菌后加入0.5 mol/L 的乙酰胺10 mL/L（終濃度5 mmol/L），用于K.lactis 重組菌的篩選。

1.1.4 工具酶、主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶Kpn I、Xho I、Sal I、Hind III、Bgl II，美國Fermentas公司；SYBR Premix Ex TaqTMII、CIAP、T4 DNA 連接酶，大連Takara 公司；質(zhì)粒小量提取、DNA 片段的純化、回收試劑盒，pfu、taq 等DNA 聚合酶，杭州寶賽生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（Amp），上海生工生物工程股份有限公司；酵母基礎(chǔ)碳源（yeast carbon base，YCB），New England Biolabs 公 司；5’-腺苷酸，美國Sigma 公司。Multiporator 電轉(zhuǎn)儀，德國Eppendorf 公司；Bio-Rad S1000 PCR 儀、Chemi Doc凝膠成像儀、CFX96 熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計，美國UNICO 公司。

1.1.5 溶液配制 原始底物：取1 mL 0.08 mol/L NaHCO3溶液溶解13.9 mg 5’-腺苷酸。反應(yīng)底物：原始底物用pH 6.0 的0.1 mol/L 琥珀酸鈉-NaOH 溶液稀釋400 倍至終濃度為0.1×10-3mol/L。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pT-AMPD為模板，擴增鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）來源并經(jīng)密碼子優(yōu)化的AMPD 基因，Xho I 和Sal I 雙酶切該片段，連接至經(jīng)同樣雙酶切的載體pKLAC1，構(gòu)建質(zhì)粒pKLAC1-AMPD。以該質(zhì)粒為模板，分別利 用pLAC4-AMPD-F/R、amdS-F/R 引 物，擴 增pLAC4-αMF-AMPD-tLAC4 片段和pADH2-amdSTT 片段，與質(zhì)粒pMD 19T-simple 連接，構(gòu)建質(zhì)粒pTLA 和pT-amdS。

用酸性玻璃珠法提取酵母染色體基因組，以S.cerevisiae W303-1A 基因組為模板，pScGAL7-F/R為引物，擴增得到長度為301 bp 的pScGAL7 片段，Kpn I 和Hind III 雙酶切連接至同樣酶切的質(zhì)粒pTLA，替換pLAC4，構(gòu)建質(zhì)粒pTGA。質(zhì)粒pT-amdS經(jīng)Bgl II 酶切后膠回收目的片段（2 527 bp）后連接至Bgl II 單酶切并經(jīng)CIAP 去磷酸化的線性化質(zhì)粒pTGA，經(jīng)Dir1-F/R 引物驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pTGA-amdS。

以K.lactis GG799 基因組為模板，分別以18S rDNA-3’-F/R 和18S rDNA-5’-F/R 為引物，擴增得到長度為1 199 bp 的18S rDNA-3’ 片段和562 bp的18S rDNA-5’片段，采用重疊延伸PCR 擴增得到18S rDNA-3’-18S rDNA-5’融合片段，與質(zhì)粒pMD 19T-simple 連接，構(gòu)建質(zhì)粒pTR。

質(zhì)粒pTGA-amdS 經(jīng)Kpn I 酶切后膠回收目的片段（5 282 bp）后連接至Kpn I 單酶切并經(jīng)CIAP去磷酸化的線性化質(zhì)粒pTR，經(jīng)Dir2-F/R 引物驗證正確的重組表達載體命名為pTRGA-amdS。

1.2.2 重組載體電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799 Sac II 線性化重組表達載體pTRGA-amdS 后電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799，涂布YCB 平板，于30 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取單菌落提取染色體基因組，利用Int-F/R 引物進行PCR 驗證，正確整合的重組菌可以擴增得到大小為2 032 bp 的片段。

1.2.3 內(nèi)參基因GAPDH 的克隆及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以K.lactis/pTRGA-amdS 染色體為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中K.lactis 三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）序列（GenBank 登錄號X52871）設(shè)計特異性引物GAPDH-F/R，擴增得到941 bp 的片段，連接至質(zhì)粒pMD 19-T simple，轉(zhuǎn)化E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，委托上海生工公司測序，得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-GAPDH。AMPD 基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為pT-AMPD。

1.2.4 GAPDH 基因和AMPD 基因RT-QPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-GAPDH 和pT-AMPD為標(biāo)準(zhǔn)品，用微量核酸定量儀測定濃度后相應(yīng)的分子數(shù)（拷貝數(shù)）為

式中：m 為DNA 質(zhì)量，g；L 為DNA 長度，bp。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每微升質(zhì)粒溶液所含的拷貝數(shù)，對其進行10 倍梯度稀釋后用作RT-QPCR 反應(yīng)的模板，其中pT-GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至103、104、105、106、107個拷貝/μL 的樣品，pT-AMPD 標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至102、103、104、105、106個拷貝/μL的樣品。根據(jù)GAPDH 和AMPD 基因序列，分別設(shè)計RTQPCR 反應(yīng)引物RT-GAPDH-F/R 和RT-AMPD-F/R，擴增產(chǎn)物大小為144，142 bp。反應(yīng)體系（10 μL）：SYBR Premix ExTaqTMII PCR buffer 5 μL，模板0.5 μL，上下游引物各0.3 μL，滅菌的dd H2O 3.9 μL；擴增條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。每個濃度設(shè)置3 個平行反應(yīng)。以起始模板中質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，不同濃度梯度下的Ct 值為縱坐標(biāo)，建立GAPDH 和AMPD 標(biāo)準(zhǔn)曲線。RTQPCR 的擴增效率為

式中：S 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.5 AMPD 基因拷貝數(shù)的檢測 提取重組菌染色體基因組并稀釋至40～60 ng/μL 后作為模板，與上述測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的RT-QPCR 反應(yīng)同步進行，得到重組菌基因組中GAPDH 和AMPD 基因的Ct 值，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到基因的初始拷貝數(shù)，因K.lactis GG799 為單倍體菌株，且GAPDH 在基因組中為單拷貝，AMPD 基因的拷貝數(shù)為

式中：CopyA為目的基因起始模板拷貝數(shù)；CopyG為GAPDH 基因起始模板拷貝數(shù)。

1.2.6 重組菌AMP 脫氨酶酶活測定 AMP 脫氨酶酶活定義：在pH 6.0，60 ℃條件下，反應(yīng)液于波長265 nm 處吸光值每分鐘改變0.001 為酶的一個活力單位。

其中：△A265為試驗組與對照組在265 nm 處吸光值的差值；K 為待測酶液的稀釋倍數(shù)；T 為反應(yīng)時間，min。

AMP 脫氨酶的酶活參照文獻[25]的方法采用紫外分光光度計檢測：在試管中加入3 mL 反應(yīng)底物后置于60 ℃水浴鍋中保溫5 min，加入100 μL 稀釋適當(dāng)倍數(shù)的待測酶液并充分混勻，立即計時，反應(yīng)15 min，加入3 mL 10%（v/v）高氯酸溶液終止反應(yīng)。對照試驗方法同上，反應(yīng)底物60 ℃保溫后冰水預(yù)冷，加3 mL 10%（v/v）的高氯酸后再加100 μL 待測酶液混勻。紫外分光光度計于265 nm 處，用光程10 mm 的石英比色皿測定吸光值（以去離子水校零）。

YEPD 平板活化重組菌，挑取單菌落接種于YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)36 h 后轉(zhuǎn)接至50 mL YEPD 培養(yǎng)基，使菌體初始OD600在0.5 左右，30 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)120 h，測定發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活，設(shè)置3 個平行。

1.2.7 重組菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性測定 YEPD 平板活化重組菌，挑取單菌落接種于20 mL YCB 培養(yǎng)基（100 mL 搖瓶裝液量為20 mL），30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)接至20 mL 新鮮的YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h，測定菌液OD600，記為N，轉(zhuǎn)接至新鮮YEPD 培養(yǎng)基中，并控制菌體初始OD600在0.1 左右，每隔12 h 重復(fù)此操作，共轉(zhuǎn)接10 次至酵母總繁殖時間為120 h，取適量菌體用無菌水稀釋后分別涂布YCB 及YEPD 平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，計相應(yīng)平板上的菌落數(shù)，分別記為A1和A2。酵母繁殖世代及質(zhì)粒穩(wěn)定性計算公式如下

式中：n 為繁殖世代；N：菌液OD600值；A1為YCB 平板菌落數(shù)；A2為YEPD 平板菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體pTRGA-amdS 的構(gòu)建

以質(zhì)粒pT-AMPD 為模板PCR 擴增得到AMPD 片段大小為1 476 bp，凝膠電泳顯示在1.1～1.7 kb 有單一核酸條帶，測序后與目的序列進行BLAST 比對，一致性達到100%，將其連接至載體pKLAC1，酶切驗證（圖1），構(gòu)建重組質(zhì)粒pKLAC1-AMPD。以該質(zhì)粒為模板，PCR 擴增分別獲得4.3 kb的APMD 基因表達框（pLAC4-αMF-AMPD-tLAC4）和2.6 kb 的篩選標(biāo)記基因表達框（pADH2-amdSTT），連接載體pMD 19T-simple，經(jīng)測序及BLAST比對表明成功構(gòu)建質(zhì)粒pTLA 和pT-amdS。

采用強啟動子是實現(xiàn)外源基因高效表達的另一途徑，最常用的啟動子包括S.cerevisiae 的磷酸甘油酸激酶基因（PGK）啟動子和酸性磷酸酶基因（PHO5）啟動子，K.lactis 的β-半乳糖苷酶基因（LAC4）啟動子[3]。在實驗室前期啟動子研究工作中，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae 來源的pScGAL7 性能優(yōu)于K.lactis 自身來源的pLAC4（數(shù)據(jù)他處發(fā)表），因此以pScGAL7（301 bp）調(diào)控AMPD 的表達，構(gòu)建質(zhì)粒pTGA。

圖1 質(zhì)粒pKLAC1-AMPD 的酶切驗證Fig.1 Enzymatic digestion of plasmid pKLAC1-AMPD

根據(jù)1.2.1 節(jié)所述方法，依次構(gòu)建質(zhì)粒pTGAamdS 和pTR，Kpn I 酶切后連接上述兩個質(zhì)粒得重組表達載體pTRGA-amdS，具體構(gòu)建流程見圖2，酶切驗證見圖3。

圖2 重組表達載體pTRGA-amdS 的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant expression vector pTRGA-amdS

圖3 重組表達載體pTRGA-amdS 酶切驗證Fig.3 Enzymatic digestion of recombinant expression vector pTRGA-amdS

2.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及驗證

重組載體pTRGA-amdS 經(jīng)Sac II 酶切線性化后電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799，與基因組中18S rDNA發(fā)生同源重組，將AMPD 基因整合到染色體中，α因子信號肽（α-Mating Factor，αMF）介導(dǎo)下實現(xiàn)AMP 脫氨酶的分泌表達，amdS 基因編碼的乙酰胺酶能將培養(yǎng)基中的乙酰胺轉(zhuǎn)化為K.lactis 可利用的氮源，只有正確整合的重組菌才能在YCB 培養(yǎng)基中生長，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取菌落明顯的轉(zhuǎn)化子，提取染色體基因組，設(shè)計特異性引物Int-F/R，陽性轉(zhuǎn)化子PCR 擴增片段大小為2 032 bp，而原始菌株無PCR 產(chǎn)物（圖4），篩選得到10 株陽性重組菌，-70℃甘油管保藏待用。

圖4 重組菌K .lactis/pTRGA-amdS 的PCR 驗證Fig.4 Integrated identification of recombinant K .lactis/pTRGA-amdS

2.3 重組菌AMPD 基因拷貝數(shù)的測定

以基因組中單拷貝的GAPDH 為內(nèi)參基因，PCR 擴增得到941 bp 的目的片段，測序結(jié)果與K.lactis NRRL Y-1140 的GAPDH 基因序列進行BLAST 比對，一致性達到99.7%，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pTGAPDH，Xho I 和Bgl II 酶切驗證（圖5）。采用RTQPCR 建立GAPDH 和AMPD 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6?？芍珿APDH 和AMPD 基因的熔解曲線均為單一峰，表明反應(yīng)過程中未出現(xiàn)非特異性擴增，特異性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為

y=-3.584 7x+39.988 和y=-3.357 3x+37.677，

相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.998 4 和0.999 1，擴增效率分別為0.9 和0.985 4，符合RT-QPCR 絕對定量擴增效率的要求。以稀釋后的陽性重組菌染色體DNA為模板進行RT-QPCR 反應(yīng)，GAPDH 和AMPD 基因的Ct 值如表3 所示，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算即可得到反應(yīng)體系中GAPDH 和AMPD 基因的初始拷貝數(shù)，可得10 株重組菌的AMPD 基因拷貝數(shù)從1～3 個。

圖5 質(zhì)粒pT-GAPDH 的酶切驗證Fig.5 Enzymatic digestion of plasmid pT-GAPDH

K.lactis 染色體中存在68 個rDNA 串聯(lián)重復(fù)序列，每個單元由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成，以rDNA序列為同源重組的整合位點兼具高效和穩(wěn)定的優(yōu)點而備受青睞。Lin 等[27]利用2.7 kb 的rDNA 序列、URA3 缺陷型篩選標(biāo)記介導(dǎo)葡糖淀粉酶在S.cerevisiae 中整合表達，拷貝數(shù)為25～140。Wery 等[20]以3 kb rDNA 序列同源重組并通過G418 篩選得到50個拷貝的重組紅法夫酵母（P.rhodozyma）。Klabunde 等[18]以H.polymorpha 來源的2.4 kb 的25SNTS1-5S-NTS2 為同源重組位點構(gòu)建了多宿主適用的整合型載體，拷貝數(shù)為30～40。但是Steinborn 等[21]以A.adeninivoras 為宿主菌，選取H.polymorpha 來源的rDNA 不同位置的序列構(gòu)建了一系列重組載體，均得到單拷貝整合重組菌。相似的是，Wartmann等[22]研究以A.adeninivoras rDNA 為整合位點時發(fā)現(xiàn)重組菌均以單拷貝或低拷貝整合。研究發(fā)現(xiàn)，rDNA 單元中整合位點的位置、載體的大小會影響整合拷貝數(shù)及穩(wěn)定性。目前對于rDNA 整合的分子機制尚不清楚，推測HOT 序列可能與整合穩(wěn)定性相關(guān)[28]，該序列是具有重組刺激活性的順式作用元件，能夠促進或激活遺傳基因的交流，rDNA 中存在2個HOT 序列，分別位于35S rDNA 前體5’端轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游和3’ 端的下游，此外，rDNA 中存在的Fob1 因子、Sir2p、RAD52 因子和MRX 復(fù)合體因子等重要功能元件均會影響整合的效率和穩(wěn)定性[6，18]。另外，缺陷型篩選標(biāo)記或弱啟動子的選擇下形成的強選擇壓力易于獲得高拷貝重組菌。本研究以完整的18S rDNA 序列為整合位點、amdS 為篩選標(biāo)記構(gòu)建重組載體，重組菌整合拷貝數(shù)為1～3。在此基礎(chǔ)上，可以通過改變整合位點在rDNA 的位置以及利用缺陷型啟動子或弱啟動子調(diào)控amdS 基因來篩選高拷貝重組菌。

圖6 GAPDH 和AMPD 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.6 Construction of standard curve of GAPDH and AMPD gene

表3 實時熒光定量PCR 檢測重組菌AMPD 基因的整合拷貝數(shù)Table 3 Estimated AMPD gene copy number of recombinants by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 重組菌AMP 脫氨酶酶活測定

2.4.1 重組菌AMPD 基因拷貝數(shù)與AMP 脫氨酶酶活之間的關(guān)系 將含不同AMPD 基因整合拷貝的重組菌接種于YEPD 培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵上清液重組AMP 脫氨酶酶活，結(jié)果如圖8 所示。重組菌基因組中AMPD 基因拷貝數(shù)的差異影響AMP 脫氨酶的表達水平，在同樣發(fā)酵條件下，只含1 個AMPD 基因拷貝的重組菌發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活性最低，含3 個AMPD 基因拷貝的重組菌酶活性最高，達到（444.44±23.15）U/mL，比前者提高了88%，含2個AMPD 基因拷貝的重組菌酶活介于1 個和3 個拷貝的重組菌，表明在一定范圍內(nèi)隨著拷貝數(shù)的增加，重組菌的酶活相應(yīng)提高，與Marx[9]等研究結(jié)果一致，因此，提高目的基因在宿主菌株中的拷貝數(shù)是提高外源蛋白表達量的有效途徑。雖然本試驗中重組菌拷貝數(shù)較低，但在強啟動子pScGAL7 的調(diào)控下外源基因仍得到高效表達。

圖7 重組菌AMP 脫氨酶酶活性與AMPD 基因拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.7 Relationship between AMP deaminase activity and the copy number of the AMPD gene in recombinants

2.4.2 培養(yǎng)基成分對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響重組菌K.lactis/pTRGA-amdS 中AMPD 基因的表達受pScGAL7 調(diào)控，該啟動子為非嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子，由乳糖或半乳糖誘導(dǎo)，但不完全被葡萄糖抑制。在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別測定重組菌菌體生長量和發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活，結(jié)果如圖9所示。在K.lactis 中，pScGAL7 在缺少誘導(dǎo)物的條件下存在一定量的本底表達，AMP 脫氨酶酶活為（445±11.67）U/mL，誘導(dǎo)條件下，YEPDG 培養(yǎng)基中酶活為（560±20）U/mL，YEPG 培養(yǎng)基中酶活最高，為（590±13.33）U/mL，與非誘導(dǎo)條件下相比分別提高了25.8%和32.6%，而在不同培養(yǎng)基中重組菌菌體生長量相當(dāng)，進一步表明酶活的提高是由于誘導(dǎo)物存在下啟動子調(diào)控外源蛋白表達的能力增強，且隨著誘導(dǎo)物濃度的增加，酶活相應(yīng)提高。

2.5 乳酸克魯維酵母整合表達體系穩(wěn)定性

在無選擇壓力條件下，與游離型表達載體相比，整合型表達載體具有在宿主菌基因組中穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點。根據(jù)1.2.7 節(jié)所述方法，對構(gòu)建的重組表達載體在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性進行了測定，重組菌傳代58 次后的穩(wěn)定性為98.59%，表明整合于K.lactis基因組中的外源基因具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

以18S rDNA 為同源重組的整合位點構(gòu)建了適用于K.lactis 的整合型表達載體pTRGA-amdS，并實現(xiàn)了AMP 脫氨酶在宿主菌中的分泌表達。所構(gòu)建的載體在以下方面具有一定的優(yōu)勢：1）以rDNA為同源重組位點，外源基因整合于宿主細(xì)胞基因組中，且在無選擇壓力條件下穩(wěn)定遺傳；2）線性化重組載體后，同源重組片段去除了E.coli 來源的ori序列和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），減小了載體的大小，同時提高了穩(wěn)定性和生物安全性[12]；3）以amdS 為篩選標(biāo)記，可直接從野生型菌株出發(fā)，不需要利用URA、LEU 或TRP 等營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，省去了營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選，并避免了回復(fù)突變的問題[2]，此外，也降低了使用G418、潮霉素等抗生素在篩選中的成本，不會對環(huán)境和人類產(chǎn)生危害；4）在整合拷貝數(shù)較低的情況下，強啟動子pScGAL7調(diào)控外源基因的表達達到較高的胞外蛋白產(chǎn)量，另外，因rDNA 在K.lactis 中基因組中存在70 個左右拷貝，該表達載體也為同時共表達多個外源基因（如酵母分泌途徑中的輔助因子或分子伴侶等）提供了可能[7-8]。

與此同時，該表達載體也存在一定的不足之處，即重組菌整合拷貝數(shù)較低，推測可能原因一方面是本研究所選取的同源臂序列為完整的18S rDNA，該位點具有高度保守性，且同源重組片段缺少了HOT、Fob1 等重要功能元件，因此影響了整合的效率[6，18]，另一方面是調(diào)控篩選標(biāo)記的pADH2 為強啟動子，重組菌只需達到較低拷貝即能在YCB 平板上生長，不利于拷貝數(shù)的復(fù)制。為了避免上述情況，后續(xù)試驗可以從兩個角度出發(fā)，一是對K.lactis的rDNA 序列進行分析，選擇合適的同源臂序列，二是將amdS 基因前的啟動子替換為缺陷型啟動子或弱啟動子，通過增強選擇壓力來篩選高拷貝重組菌。

4 結(jié)語

利用本研究構(gòu)建的表達載體能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達，為K.lactis 進行分子改造提供了理想工具。因目前對于rDNA 的重要元件、重組的分子機制研究尚不完善，通過不斷深入研究，以rDNA 重復(fù)單元作為同源重組的整合位點將在基因工程應(yīng)用中發(fā)揮越來越重要的作用。