谷氨酰胺酶基因的克隆、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

張美丹，饒志明，張 顯，楊套偉，徐美娟

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）能夠催化L-谷氨酰胺水解形成L-谷氨酸和氨。谷氨酰胺酶主要分布在微生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。哺乳細(xì)胞谷氨酰胺酶在能源和氮源代謝中起關(guān)鍵作用，因此，傳統(tǒng)意義上被認(rèn)為是一種線粒體酶[1]。哺乳動(dòng)物谷氨酰胺酶通常被分為兩個(gè)類型：肝型和腎型，肝型谷氨酰胺酶和腎型谷氨酰胺酶均能夠被一定濃度的磷酸鹽激活[1-3]。谷氨酰胺酶在微生物中分布很廣，已經(jīng)被報(bào)道過的菌體有：大腸桿菌（Escherichia coli）[4]、芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，Bacillus sp.LKG-01）[5-6]、乳桿菌（Lactobacillus reuteri KCTC3594）[7]、青霉菌（penicillium politans NRC510）[8]、米曲霉（Aspergillus oryzae RIB40）[9]和酵母（Zygosaccharomyces rouxii，Zygosaccharomyces rouxii NRRL-Y 2547）[10-11]等。自然界中不同來源的谷氨酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)具有很大的差距，因此谷氨酰胺酶的應(yīng)用相應(yīng)的也有所不同。目前，谷氨酰胺酶的研究主要集中在制藥和食品工業(yè)中。在藥物方面，谷氨酰胺酶被用于抗癌制劑研究，癌細(xì)胞沒有L-谷氨酰胺合成機(jī)制，通過谷氨酰胺酶消耗體內(nèi)環(huán)境中的谷氨酰胺，從而使得癌細(xì)胞因缺乏谷氨酰胺而被“餓死”[12-13]。在食品行業(yè)（尤其是醬油發(fā)酵）中，耐鹽性谷氨酰胺酶一直是研究的熱點(diǎn)[14-21]。醬油在發(fā)酵過程中，會(huì)有很大部分的谷氨酰胺因遇高溫轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸，這很大的程度上影響了醬油的風(fēng)味和營養(yǎng)。因此，在發(fā)酵過程中額外添加谷氨酰胺酶，從而增加谷氨酸、減少焦谷氨酸的生成從而提高了醬油的風(fēng)味和營養(yǎng)[17-22]。也有研究者們將谷氨酰胺酶用于茶氨酸的合成[23-24]。

本研究通過將實(shí)驗(yàn)室保藏的一株枯草芽孢桿菌作為谷氨酰胺酶基因的來源，將其在枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168，BS168）中進(jìn)行克隆、表達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，隨后對重組菌在5 L 發(fā)酵罐進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌是本實(shí)驗(yàn)室的一株保藏菌；大腸桿菌JM109（Escherichia coli，E.coli JM109）、枯草芽孢桿菌168、表達(dá)載體pMA5 均為實(shí)驗(yàn)室所有；連接載體pMD-18T、PCR 酶相關(guān)試劑、T4 DNA 連接酶以及所有的限制性內(nèi)切酶BamH I 和Nde I 等都在TaKaRa 公司上購買；細(xì)菌全基因組快速提取試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、膠回收試劑盒和引物合成等都來自上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)；SBA-40E 谷氨酸-葡萄糖分析儀買自山東科學(xué)院生物研究所；AKTA 蛋白純化層析系統(tǒng)在GE Healthcare 公司購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取，ylaM 基因的克隆 枯草芽孢桿菌基因組提取的方法參考細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒說明書。引物設(shè)計(jì)序列：ylaM-F：5`-ACCGCATATGATGGTATGCCAGCATAATGAT -3`，下劃線為Nde I；ylaM-R：5`-ACCGGGATCCTTAGT GGTGGTGGTGGTGGTGAAAAATACTCAGCCTGT -3`，下劃線分別為BamH I 和組氨酸標(biāo)簽。PCR 擴(kuò)增體系中包括0.5 μL 全基因組DNA；5 μL 10×Buffer；4 μL dNTP Mixture；0.5 μL 上下引物；1 μL E Taq DNA 聚合酶；ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min ；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后與pMD18-T載體進(jìn)行連接，接著連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）的LB 平板上進(jìn)行篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證并進(jìn)行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 將pMD18T-ylaM和pMA5 分別用BamH I 和Nde I 進(jìn)行雙酶切，將所切的目的片段和載體進(jìn)行回收純化，將純化后的目的基因ylaM 和載體pMA5 片段并使用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，然后放置16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli JM109 感受態(tài)中，通過帶有100 μg/mL Amp 的LB 平板篩選陽性重組菌體E.coli JM109/pMA5-ylaM，提質(zhì)粒通過相應(yīng)的酶切位點(diǎn)驗(yàn)證重組載體。將重組子pMA5-ylaM 再通過文獻(xiàn)[25]所使用的化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168 中，通過帶有50 μg/mL 卡那霉素的LB 平板篩選陽性重組菌BS168/pMA5-ylaM，提質(zhì)粒通過單雙酶切驗(yàn)證是否有重組子轉(zhuǎn)進(jìn)去。

1.2.3 重組菌的谷氨酰胺酶表達(dá)和純化 將重組菌體BS168/pMA5-ylaM 先接入10 mL LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min 下培養(yǎng)8～12 h，之后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖25、酵母粉21、蛋白胨14、谷氨酸2、K2HPO41.25、KH2PO40.75、MgCl21、pH 6.9～7.0，在30 ℃、180 r/min 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)20 h。使用4 ℃低溫離心機(jī)離心收集菌體（4 ℃，10 000 g，10 min），將離心所得的重組菌體使用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液懸洗2～3 次，之后根據(jù)生物量使用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液將菌體定容至相應(yīng)的體積進(jìn)行懸浮。細(xì)胞懸液中加入20 μL 200 g/mL溶菌酶（lysozyme），放置冰盒或者4 ℃冰箱作用2～3 h左右，待菌體呈蛋清狀之后將處理液放入超聲波破碎儀中超聲10 min 左右，將細(xì)胞破碎液離心（4 ℃，10 000 g，20 min），取上清。獲得的細(xì)胞上清過膜處理之后使用Ni-NTA 親和色譜法純化N-末端加入His-tag 的谷氨酰胺酶，清洗、上樣和洗脫過程根據(jù)公司所提供的儀器操作步驟來進(jìn)行。將細(xì)胞上清液和純化后的谷氨酰胺酶用于酶活測定和SDSPAGE 分析。

1.2.4 谷氨酰胺酶的酶活測定 谷氨酰胺酶酶活通過L-谷氨酸的生成量來測定。酶活測定方法：將440 μL 100 mmol/L 谷氨酰胺溶液和440 μL 100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行混合，接著放入37 ℃的水浴鍋中5 min，加入20 μL 的酶液在水浴鍋中發(fā)應(yīng)5 min 后，迅速加入100 μL 的反應(yīng)終止液（15%的三氯乙酸）上下震蕩混勻，之后將反應(yīng)物放入離心機(jī)中離心（10 000 g，15 min）[26]。取反應(yīng)物的上清液25 μL 打進(jìn)谷氨酸-葡萄糖分析儀中進(jìn)行谷氨酸測定。谷氨酰胺酶的酶活單位定義為，在37 ℃、pH 7.5 的條件下，每分鐘生成1 μmol 的谷氨酸所需要的谷氨酰胺酶的量。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究 反應(yīng)最適pH 和pH 穩(wěn)定性研究：使用不同pH 的反應(yīng)體系（緩沖液：pH 5.0～6.0，0.1 mol 醋酸-醋酸鈉；pH 6.0～7.0，0.1 mol 磷酸鹽；pH 7.0～8.0，0.1 mol Tris-HCl；pH 8.0～9.5，0.1 mol甘氨酸-NaOH）進(jìn)行酶活測定，最大酶活定義為100%。在4 ℃條件下，將儲(chǔ)存在不同pH 緩沖液的酶液放置一段時(shí)間，每隔2 h 后進(jìn)行一次酶活測定，將最初谷氨酰胺酶的酶活定義為100%。

反應(yīng)最適溫度和熱穩(wěn)定研究：將谷氨酰胺酶反應(yīng)體系放置在不同溫度（20～65 ℃）的水浴鍋中先預(yù)熱10 min，之后加入20 μL 的酶液反應(yīng)5 min，迅速加入100 μL 的反應(yīng)終止液（15%的三氯乙酸），最大酶活定義為100%。在4、20、25 ℃和30 ℃保溫12 h，每隔2 h 取樣并進(jìn)行酶活測定，將未加熱的谷氨酰胺酶酶活定義為100%。

金屬離子和EDTA 對酶活的影響：在谷氨酰胺酶反應(yīng)體系中分別加入1 mmol/L 的金屬離子EDTA、K+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、La3+、Ba2+等金屬離子，接著進(jìn)行谷氨酰胺酶的酶活測定，未加入金屬離子的谷氨酰胺酶活定義為100%。

耐鹽性測定和高鹽條件對酶穩(wěn)定性的影響：谷氨酰胺酶反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的NaCl（0～20%），之后進(jìn)行酶活反應(yīng)并分析谷氨酸的生成，未加入NaCl 反應(yīng)的谷氨酰胺酶酶活定為100%。在4℃條件下，將儲(chǔ)存在不同鹽濃度下的酶液放置一段時(shí)間，每隔0.5 h 后進(jìn)行一次酶活測定，將最初在不同鹽濃度下的谷氨酰胺酶的酶活定義為100%。

1.2.6 5 L 罐發(fā)酵培養(yǎng) 取凍管中的菌液進(jìn)行劃平板，挑取單菌落至10 mL 的LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)10～12 h（37 ℃，180 r/min），接取10%的菌液轉(zhuǎn)入150mL的LB 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12 h（37 ℃，180 r/min）。將上述培養(yǎng)液接入含有2 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速600 r/min，pH 7.0（pH 由30%的氨水和10%的磷酸進(jìn)行酸堿調(diào)控）的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。補(bǔ)料措施為：碳源為50%的葡萄糖，氮源為50%的酵母粉，前18 h 發(fā)酵條件同前面，18 h 后進(jìn)行自動(dòng)補(bǔ)料，每個(gè)小時(shí)補(bǔ)充3 g/L 的碳源和2 g/L 的氮源。每隔一段時(shí)間進(jìn)行取樣，進(jìn)行生物量和酶活測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組載體的構(gòu)建和表達(dá)

以枯草芽孢桿菌全基因組作為模板進(jìn)行PCR，通過電泳得到的目的基因大小為0.93 kb，將純化后的目的基因與pMD18T 連接轉(zhuǎn)入E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，在抗性平板中挑取陽性轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證并進(jìn)行測序。接著使用BamH I 和Nde I 將目的基因與載體pMA5 切下并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌168 中，在抗性平板中挑選陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。重組質(zhì)粒pMA5-ylaM 經(jīng)BamH I 單切大小為8.4 kb，BamH I 和Nde I 雙切的大小分別為7.5 kb 和0.93 kb（圖1）。將構(gòu)建好的重組菌B.subtilis/pMA5-ylaM 進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，獲得的粗酶過鎳柱純化，將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析，純化后的蛋白大小為32 kDa 左右（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.1 Enzyme digestion of recombinant plasmid

圖2 重組蛋白酶的SDS-PAGE 電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified glutaminase form recombinant

2.2 谷氨酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 反應(yīng)最適pH 和pH 穩(wěn)定性研究 在不同pH下測得的谷氨酰胺酶活并獲得一條曲線，從圖3（a）獲知，在pH 7.5 的緩沖液下，谷氨酰胺酶酶活最適。在4 ℃條件下，每隔2 h，在不同pH 取樣測酶活獲得pH 的穩(wěn)定曲線，如圖3（b）所示，該谷氨酰胺酶在pH 6.5～8 之間穩(wěn)定性很好，而低于pH 6.0 或高于8.5 時(shí)，酶活力有所下降。

圖3 谷氨酰胺重組酶的最適pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.3 Optimal pH and pH stability of the recombinant glutaminase

2.2.2 反應(yīng)最適溫度和熱穩(wěn)定性研究 在不同的反應(yīng)溫度下，測谷氨酰胺酶活。從圖4（a）可知，谷氨酰胺酶的最適溫度是55 ℃。隨著溫度升高，酶活力有所上升；當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，酶活力下降。由圖4（b）所示，在低溫條件下保存對酶活力影響不大，當(dāng)溫度為大于30 ℃時(shí)，酶活力下降就明顯了。

圖4 谷氨酰胺酶最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and thermal stability of the recombinant glutaminase

2.2.3 金屬離子和EDTA 的影響 從圖5 分析金屬離子對谷氨酰胺酶活的影響得知，La3+、Zn2+、Fe3+和Al3+對谷氨酰胺酶活力具有一定程度上的抑制作用，部分金屬離子對其有促進(jìn)作用，但是效果不是很明顯。

圖5 金屬離子和EDTA（1 mmol/L）對酶活的影響Fig.5 Effect of metal ion（1 mmol/L）on glutaminase activity

2.2.4 谷氨酰胺酶的耐鹽性研究 反應(yīng)體系中不同濃度的NaCl 條件下所測得的谷氨酰胺酶酶活曲線如圖6 所示，隨著反應(yīng)體系中NaCl 的濃度的不斷升高，相對酶活相應(yīng)的下降。但是，在15%～17.5%的NaCl 條件下，殘余酶活力依然有50%以上，說明該谷氨酰胺酶具有一定的耐鹽性。在4 ℃條件下，每隔0.5 h，在不同鹽濃度下取樣測酶活獲得高鹽條件下谷氨酰胺酶的穩(wěn)定曲線，如圖7 所示，該谷氨酰胺酶在12.5%～17.5%NaCl 之間穩(wěn)定性很好，當(dāng)鹽濃度為20%時(shí)，3 h 后，谷氨酰胺酶的相對酶活力僅下降了34.76%左右。

圖6 不同濃度的NaCl 對酶活的影響Fig.6 Salt to lerance of recombinant glutaminase

圖7 高鹽對谷氨酰胺酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects on stability of glutaminase in the high concentration of salt

2.3 5 L 罐發(fā)酵結(jié)果

5 L 罐的分批發(fā)酵結(jié)果如圖8（a）所示，隨著重組菌體的生長酶活產(chǎn)量也有所增長，當(dāng)葡萄糖消耗的差不多時(shí)菌體也不再增長。重組菌發(fā)酵18 h，重組菌細(xì)胞干重（CDW）和谷氨酰胺酶比酶活最高分別達(dá)到了4.51 g/L 和58.61 U/mL，24 h 后菌體不再生長而谷氨酰胺酶酶活有稍微的下降。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果如圖8（b）所示，發(fā)酵18 h后在殘?zhí)菫?～5 g/L 時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，每小時(shí)添加3 g/L的碳源和2 g/L 的氮源，重組菌體和酶活產(chǎn)量也有所增加，細(xì)胞干重最高將近有23.36 g/L，發(fā)酵54 h時(shí)谷氨酰胺酶最高酶活產(chǎn)量達(dá)到了215.06 U/mL。相比較分批發(fā)酵結(jié)果，分批補(bǔ)料發(fā)酵的谷氨酰胺酶酶活產(chǎn)量提高了3.67 倍，細(xì)胞干重增加了5.18 倍。

圖8 5 L 罐發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果Fig.8 Fermentation and fed -batch fermentation of glutaminase in 5 L fermenter

3 結(jié)語

本研究枯草芽孢桿菌來源的谷氨酰胺酶在枯草芽孢桿菌168 中得到了有效的表達(dá)，純化后比酶活達(dá)到了939.47 U/mg。谷氨酰胺酶在15%～17.5%的高鹽濃度下相對酶活高于50%，表明了該谷氨酰胺酶具有比較好的耐鹽性。食品業(yè)中，醬油的含鹽量通常為14%～18%[15]，這很大程度上限制了一般的谷氨酰胺酶應(yīng)用。本研究獲得的重組谷氨酰胺酶克服了在高鹽濃度下易失活的缺點(diǎn)，為下一步在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。本研究直接采用了葡萄糖-谷氨酸分析儀對酶活產(chǎn)物進(jìn)行測定分析，該方法相比較谷氨酰胺酶測定試劑盒和高效液相色譜法對酶活測定更加的簡單、快速和穩(wěn)定，這為之后的發(fā)酵控制研究提供了便利和可操作性。發(fā)酵18 h 后，通過每個(gè)小時(shí)添加3 g/L 的碳源和2 g/L 的氮源進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，谷氨酰胺酶的酶活產(chǎn)量在54 h能達(dá)到215.06 U/mL。