大別山區(qū)茶樹種質(zhì)資源多樣性的ISSR分析

杜婷婷

摘 要 大別山區(qū)茶樹栽培歷史悠久，有著豐富的茶樹種質(zhì)資源，對(duì)茶樹的品種選育和生物技術(shù)的研究有著很大的作用。最近幾年已經(jīng)發(fā)展日益成熟的ISSR簡單重復(fù)序列間隔區(qū)技術(shù)，已經(jīng)能夠從DNA反應(yīng)出來的水平展示出各個(gè)材料之間的差別和遺傳特點(diǎn)，這個(gè)方法技術(shù)已經(jīng)成為研究生物遺傳多樣性的非常有利的工具，并且方法簡單，使用方便快捷。本文以舒城縣舒茶鎮(zhèn)九一六茶園為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行茶樹種質(zhì)多樣性的ISSR分析。此次研究可為大別山區(qū)茶樹的持續(xù)發(fā)展利用以及生物多樣性的保護(hù)提供部分參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 大別山區(qū) 茶樹 種質(zhì)資源 ISSR 多樣性分析

中圖分類號(hào)：S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

0引言

茶樹的種質(zhì)資源是自然進(jìn)化的產(chǎn)物，它在生長進(jìn)化過程中由于各種外界和內(nèi)部的因素產(chǎn)生了很多的遺傳變異，而這些遺傳基因中包含著許多決定它們各種特征的基因。而茶樹進(jìn)行育種的主要基礎(chǔ)是茶樹的種質(zhì)資源，茶樹育種是對(duì)茶樹種質(zhì)資源的基因選擇，并且利用優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源對(duì)茶樹進(jìn)行育種。當(dāng)前世界各地的產(chǎn)茶國對(duì)茶樹種質(zhì)資源的采集和改進(jìn)是十分關(guān)注的，茶葉市場的不斷發(fā)展和茶葉的科技創(chuàng)新是離不開茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)利用的。

1大別山茶樹種質(zhì)資源多樣性的ISSR分析

1.1供試材料樣本的收集

實(shí)驗(yàn)材料采自舒城縣舒茶鎮(zhèn)九一六茶園，共計(jì)20份茶樹種質(zhì)資源，從所選取的20份茶樹種質(zhì)資源中采取其較嫩的新梢葉片，采用硅膠干燥法收集樣品，并于-20℃冰箱保存，然后用于基因組DNA的提取。

1.2供試材料DNA的提取

實(shí)驗(yàn)前對(duì)儀器進(jìn)行提前滅菌，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)操作儀器應(yīng)該輕拿輕放，避免因?yàn)閯×业恼饎?dòng)而對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。采用改良CTAB法提取收集到的20份樣本基因組DNA，其操作方法為：（1）將CATA緩沖液置于65℃水浴預(yù)熱，同時(shí)開始制冰。（2）稱取0.5g處理后的茶樹葉片，進(jìn)行研磨，形成茶粉。（3）取0.1g研磨后的茶粉加入EP試管中，加入1ml預(yù)冷的TE清洗液和10ul巰基乙醇，進(jìn)行冰浴。（4）取出EP管進(jìn)行離心實(shí)驗(yàn)。（5）取出EP管，將上清液進(jìn)行吸取轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)新的EP試管中，加入2ml無水乙醇，混勻后靜置，讓核酸沉淀。（6）把絮狀沉淀物挑入加入800ul的75%乙醇的1.5ulEP中，進(jìn)行洗滌沉淀操作，在室溫環(huán)境下使DNA沉淀干燥。（7）使得到的DNA沉淀在50ul的ddH2O中，在-20℃中保存。（8）設(shè)置空白參照，取樣品1ul置于蛋白核酸檢測儀針頭上檢測，得出檢測結(jié)果。

通過CTAB法提取20份樣本的基因組DNA，根據(jù)得出的電泳圖可以得知OD260/OD28的值處于1.8和2.0之間，表明此次實(shí)驗(yàn)所采用的材料和方法提取的茶葉種質(zhì)資源DNA的效果比較好，得到的DNA的濃度、純度都比較高。

1.3 ISSR對(duì)茶樹遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析

在20份茶樹DNA提取的基礎(chǔ)上，用擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的ISSR引物用于樣本DNA擴(kuò)增。

根據(jù)20中茶樹種質(zhì)資源的ISSR聚類分析圖譜，可以得知：供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS值在0.589～0.774之間。其中，舒城大葉種和舒城藥茶的GS值為0.778，二者的遺傳關(guān)系最為相近。而GS值最小的是平陽特旱和日本群體種，GS值是0.589，表示平陽特旱和日本群體種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳相似系數(shù)按UPGMA方法進(jìn)行聚類，當(dāng)遺傳距離為0.730時(shí)，可以將20份茶樹種質(zhì)資源分為五大類。其中，D類還有12個(gè)茶樹種質(zhì)資源，占實(shí)驗(yàn)材料中所有種質(zhì)資源的60%，表明舒城縣其特有的茶葉種質(zhì)資源有著獨(dú)特的遺傳基因。

對(duì)大別山區(qū)茶樹種質(zhì)資源20分樣本進(jìn)行擴(kuò)增，共得到了36個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性比率是95.2%，擴(kuò)增條帶的大小介于250～1800kb之間。以最具代表性的舒城大葉種為中心，按照方位組建的四個(gè)方位群居中，多態(tài)性位點(diǎn)最多的是東北群落，而最少的是西南群落。四個(gè)方位的群落中在群內(nèi)發(fā)生遺傳變異的概率比較大。在眾多ISSR標(biāo)記位點(diǎn)處，基因流的平均值為1.6223，僅僅能夠抵質(zhì)遺傳漂變引起的基因變異。各種茶樹種質(zhì)資源在一定程度上具有一定的親緣關(guān)系，它們的基因相似性是基于它們的親緣關(guān)系，舒城大葉種、舒城藥茶和平陽特旱種質(zhì)資源遺傳多樣性比較豐富，并且在DNA的遺傳上具有很好的穩(wěn)定性。

2結(jié)語

對(duì)茶樹種質(zhì)資源多樣性的分析使用DNA分子標(biāo)記法是非常可行的，因?yàn)镈NA在遺傳上具有穩(wěn)定性，而茶樹的一些特征受到環(huán)境因素的影響是比較大的，因此，對(duì)茶樹種質(zhì)資源的多樣性分析，ISSR分析方法能夠更好地研究其種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并且能有效的鑒別出不同種類的茶葉種質(zhì)資源。部分茶樹經(jīng)過長期的自然選擇，與不同種類的茶樹進(jìn)行基因交流，使得大別山區(qū)的部分茶樹資源也發(fā)生了轉(zhuǎn)變。隨著污染日益嚴(yán)重，許多動(dòng)植物種類已經(jīng)消失，因此，通過對(duì)大別山區(qū)茶樹種質(zhì)資源的分析研究，可以為茶樹的保護(hù)以及育種等提供參考性依據(jù)。

基金項(xiàng)目：2017年安徽省教育廳自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目“大別山區(qū)茶樹種質(zhì)資源多樣性的ISSR分析”（KJ2017B03）。

參考文獻(xiàn)

[1] 王小萍，張廳，黃梅等.四川地區(qū)茶樹種質(zhì)資源葉表型性狀多樣性分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018，34（04）：89-94.

[2] 黎釗，肖斌，余有本等.基于STR分型檢測技術(shù)的89份茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，45（01）：140-146.