細(xì)胞間黏附分子-1在支氣管哮喘兒童支氣管黏膜中的表達(dá)及其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞凋亡的影響

周 潔，吉 玲，王新華，周栩平

(1.駐馬店市中心醫(yī)院新生兒科，河南 駐馬店 463000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院新生兒科，河南 鄭州 450000)

哮喘是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者及其家庭帶來(lái)嚴(yán)重影響[1-4]。哮喘的發(fā)生與支氣管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，研究支氣管上皮細(xì)胞凋亡水平對(duì)探討哮喘的發(fā)病機(jī)制具有重要作用[5]。細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族的成員之一，在呼吸道上皮反應(yīng)中起重要作用，其在白細(xì)胞滲出、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活化等過(guò)程中均起作用[6]。呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)是誘發(fā)支氣管炎、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因，嚴(yán)重威脅免疫低下患者的生命健康[7]。有研究顯示，ICAM-1在支氣管上皮細(xì)胞黏附和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其還是多種病毒的受體蛋白[8-9]。目前，ICAM-1在支氣管上皮細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)哮喘兒童支氣管黏膜組織中ICAM-1水平，并用RSV感染支氣管上皮細(xì)胞，探討ICAM-1在哮喘支氣管上皮細(xì)胞凋亡中的作用，以期為研究哮喘的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料收集駐馬店市中心醫(yī)院2014年5月至2017年12月收治的28例支氣管哮喘兒童的支氣管黏膜組織標(biāo)本，男16例，女12例，年齡4～13(8.0±0.3)歲；同時(shí)選取28例支氣管擴(kuò)張非哮喘兒童的支氣管黏膜組織作為對(duì)照，男13例，女15例，年齡6～14(10.0±0.8)歲。支氣管黏膜組織來(lái)源于纖維支氣管鏡檢查，組織標(biāo)本采集均征得患者及家屬同意，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2細(xì)胞、試劑與儀器支氣管上皮細(xì)胞16HBE購(gòu)自上海歌凡生物細(xì)胞庫(kù)，RSV由購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒保存；ICAM-1 siRNA購(gòu)自上海西寶生物科技股份有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved Caspase-3)抗體、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)抗體購(gòu)自美國(guó)CTS公司；紫外分光光度計(jì)UV-2450購(gòu)自日本島津公司，6孔板細(xì)胞爬片購(gòu)自上海晶安生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1qRT-PCR檢測(cè)支氣管黏膜組織中ICAMmRNA表達(dá)按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中的RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA的濃度和純度，-80 ℃保存。使用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR測(cè)定不同支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA的表達(dá)。ICAM-1上游引物序列為5′-GCGACCACGGACGGAATTTCT-3′，下游引物序列為5′-TCAGGACCCTAGTCGGAAGATCGA-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase，GAPDH)上游引物序列為5′-CGGAGTCAA-CGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列為5′-AGC-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，45 s；58 ℃，60 s；72 ℃，80 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算不同支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。

1.3.2Westernblot法檢測(cè)支氣管黏膜組織中ICAM-1蛋白表達(dá)用蛋白提取試劑盒提取正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中的總蛋白。用二喹啉甲酸法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。使用6孔板，每孔添加30 μg的蛋白樣品，與Loading buffer以同體積混合，100 ℃煮沸5 min。給予90 V電壓，電泳至溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)，將電壓調(diào)整至120 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的底部。在室溫條件下，50 g·L-1牛血清白蛋白封閉 90 min，同時(shí)分別加入ICAM-1一抗(11 000)、GAPDH一抗(11 000)，4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(12 000)室溫孵育 90 min。Osyssey掃描圖像，ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量=ICAM-1灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組支氣管上皮細(xì)胞16HBE用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將正常培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞16HBE分為對(duì)照組、感染組、陰性組和干擾組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不做任何處理；感染組細(xì)胞感染RSV，但不進(jìn)行轉(zhuǎn)染；陰性組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-control后感染RSV；干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ICAM-1 siRNA后感染RSV。當(dāng)支氣管上皮細(xì)胞16HBE融合為60%時(shí)，用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)。RSV感染步驟參照文獻(xiàn)[10]，當(dāng)16HBE細(xì)胞融合為65%左右時(shí)，加入不含血清的培養(yǎng)液洗滌3次，在細(xì)胞中添加感染復(fù)數(shù)=0.006 7的RSV病毒懸浮液(用不含血清的培養(yǎng)液配制)，37 ℃孵育2 h。用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4qRT-PCR和Westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞中ICAM-1mRNA和蛋白水平各組細(xì)胞干預(yù)處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平，步驟同“1.3.1、1.3.2”項(xiàng)。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組干預(yù)處理后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心 10 min，棄上清液，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將細(xì)胞重懸后，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)、5 μL 膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V-異硫氫酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)(Annexin-V-FITC)，室溫、避光反應(yīng)20 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞在干預(yù)處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平，嚴(yán)格按照IL-1β和TNF-α檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.7Westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞在干預(yù)處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，Cleaved Caspase-3、NF-κB p65一抗分別以1800和1600稀釋，其他步驟同“1.3.2”項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1ICAM-1mRNA和蛋白在不同支氣管黏膜中表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖1。正常支氣管黏膜組織和哮喘支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.13和2.64±0.25，ICAM-1 蛋白表達(dá)水平分別為0.32±0.02和1.05±0.14。哮喘支氣管黏膜組織中ICAM-1 mRNA和蛋白水平顯著高于正常支氣管黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：正常支氣管黏膜組織；2：哮喘支氣管黏膜組織。

圖1不同支氣管黏膜組織中ICAM-1蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.1ExpressionofICAM-1proteinindifferentbronchialmucosatissues(Westernblot)

2.2各組支氣管上皮細(xì)胞16HBE中ICAM-1mRNA和蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞中ICAM-1 mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.12、2.17±0.23、2.15±0.20、1.58±0.11，ICAM-1蛋白表達(dá)水平分別為0.25±0.03、1.03±0.07、1.02±0.09、0.47±0.05。感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干擾組細(xì)胞中ICAM-1 mRNA和蛋白水平均顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組支氣管上皮細(xì)胞16HBE細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞凋亡率分別為(7.62±0.71)%、(28.32±2.17)%、

(27.49±2.40)%、(14.38±1.22)%。感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干擾組細(xì)胞凋亡率顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：感染組；3：陰性組；4：干擾組。

圖2各組支氣管上皮細(xì)胞中ICAM-1蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.2ExpressionofICAM-1proteinofbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況

Fig.3Apoptosisofbronchialepithelialcellsineachgroupdetectedbyflowcytometry

2.4各組支氣管上皮細(xì)胞16HBE培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平比較對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β水平分別為1.11±0.10、1.62±0.08、1.66±0.12、1.35±0.08，TNF-α水平分別為1.64±0.13、2.38±0.21、2.39±0.20、2.01±0.12。感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干擾組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5各組支氣管上皮細(xì)胞16HBE中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白水平比較結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)照組、感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平分別為0.26±0.05、0.84±0.09、0.87±0.04、0.48±0.06，NF-κB p65蛋白水平分別為0.28±0.04、0.89±0.07、0.86±0.06、0.64±0.05。感染組、陰性組、干擾組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干擾組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平顯著低于感染組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：感染組；3：陰性組；4：干擾組。

圖4各組支氣管上皮細(xì)胞中CleavedCaspase-3、NF-κBp65蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.4ExpressionofCleavedCaspase-3andNF-κBp65proteinbronchialepithelialcellsineachgroup(Westernblot)

3 討論

支氣管哮喘是一種呼吸道免疫炎癥相關(guān)的疾病，其發(fā)生與肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞有關(guān)[11-12]。ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛表達(dá)，屬于免疫球蛋白超家族，參與細(xì)胞的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化增殖與分化，以及細(xì)胞的伸展和轉(zhuǎn)移、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要的生理和病理過(guò)程[13]。正常情況下，ICAM-1表達(dá)水平較低，而在發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，多種細(xì)胞因子作用于上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)，進(jìn)一步引起炎性因子釋放[14-15]。研究顯示，大鼠敲除ICAM-1基因后，基因缺陷的大鼠呼吸道內(nèi)炎癥程度明顯降低，提示抑制ICAM-1的表達(dá)可以降低哮喘呼吸道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕哮喘癥狀[16]。唐力瓊等[17]研究表明，用RSV誘導(dǎo)大鼠發(fā)生哮喘后，大鼠肺組織中ICAM-1水平升高，使用咳喘寧治療后，哮喘大鼠肺組織中ICAM-1水平下降。本研究收集了哮喘兒童支氣管黏膜組織和非哮喘兒童支氣管黏膜組織，用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中的表達(dá)水平高于非哮喘兒童支氣管黏膜組織，提示ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中表達(dá)上調(diào)。

呼吸道上皮細(xì)胞能夠?qū)⑼饨绛h(huán)境中的有害物質(zhì)隔離，形成免疫屏障，也是機(jī)體對(duì)抗病毒等物質(zhì)的機(jī)械屏障[18]。正常情況下，呼吸道上皮完整的組織結(jié)構(gòu)可以保護(hù)微環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)受到外界環(huán)境刺激后，呼吸道上皮細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞合成黏附因子等多種細(xì)胞分子，參與免疫反應(yīng)[19]。RSV感染后可誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞發(fā)生損傷，破壞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致呼吸道上皮組織完整性受到破壞，引起肺炎、支氣管炎、哮喘等疾病的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，RSV感染后的支氣管上皮細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α水平也升高，而下調(diào)ICAM-1后，細(xì)胞凋亡率有所降低，細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中 IL-1β、TNF-α水平下降，說(shuō)明下調(diào)ICAM-1可以緩解RSV誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷。

NF-κB與炎性因子、趨化因子等多種細(xì)胞因子的分泌有關(guān)，其在正常情況下以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激后可以被激活進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程[21]。NF-κB p65是NF-κB發(fā)揮生物學(xué)活性所必需的亞單位[22]。研究顯示，NF-κB p65在哮喘兒童肺組織中表達(dá)上調(diào)，在呼吸道上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)[23]。Caspase-3參與支氣管上皮細(xì)胞的凋亡過(guò)程，是Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的凋亡執(zhí)行子，其活化成為Cleaved Caspase-3后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[24-26]。本研究結(jié)果顯示，RSV感染后的支氣管上皮細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平升高，而下調(diào)ICAM-1后，支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)RSV感染，細(xì)胞中的Cleaved Caspase-3、NF-κB p65水平下降，提示下調(diào)ICAM-1可以通過(guò)降低Caspase-3活化水平抑制RSV誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制還可能與NF-κB p65有關(guān)。

綜上所述，ICAM-1在哮喘兒童支氣管黏膜組織中過(guò)度表達(dá)，參與哮喘的發(fā)生，在RSV誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌中具有重要作用，而其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究為今后研究哮喘的發(fā)病機(jī)制及靶向ICAM-1減少哮喘支氣管上皮細(xì)胞損傷提供了理論基礎(chǔ)。