輔助性T細(xì)胞22及其效應(yīng)分子在肝細(xì)胞癌中的檢測(cè)及意義

郝猛，李觀華，施珍

(九江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江332000)

輔助性T細(xì)胞 （Th細(xì)胞）是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，能夠輔助T、B淋巴細(xì)胞參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，其作用是通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的；參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖與分化等生理病理過(guò)程。Th22是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)Th細(xì)胞，以?xún)H分泌IL-22，而不分泌IL-17和干擾素-γ(IFN-γ)為特點(diǎn)。有研究表明，Th22細(xì)胞與自身免疫性疾病、感染性疾病等病程的免疫過(guò)程有關(guān)；最近研究證實(shí)，Th22細(xì)胞及其效應(yīng)分子存在多種腫瘤組織中分布和表達(dá)[1]。原發(fā)性肝癌的病因機(jī)制仍未明確，目前認(rèn)為其主要影響因素包括肝硬化、病毒性肝炎、遺傳因素、飲用水污染和黃曲霉毒素等，肝細(xì)胞癌（HCC）大多數(shù)以合并乙型肝炎病毒感染和肝硬化為特點(diǎn)，且一致認(rèn)為乙肝病毒(HBV)長(zhǎng)期慢性感染是誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的發(fā)生的主要因素。近年來(lái)，肝細(xì)胞癌的常規(guī)治療效果差，免疫治療成為肝細(xì)胞癌的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，Th細(xì)胞在肝細(xì)胞癌的進(jìn)展中起重要作用，因而研究肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中Th細(xì)胞及其效應(yīng)分子水平變化可以為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供理論依據(jù)和新的途徑，為肝細(xì)胞癌的防治提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年8月-2017年11月九江市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科住院臨床診斷肝細(xì)胞癌患者38例、慢性乙型肝炎患者45例和體檢科健康者26例外周血標(biāo)本；患者診斷均符合2012年歐洲肝臟病協(xié)會(huì)修訂的《原發(fā)性肝細(xì)胞癌管理指南》[2]和2015年我國(guó)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。肝細(xì)胞癌組中男性22例，女性16例，平均年齡為50.92±11.21歲，包括乙型肝炎病毒陽(yáng)性患者28例；慢性乙型肝炎組中男性26例，女性19例，平均年齡為49.32±12.81歲。另收集26名健康對(duì)照組的外周血，其中男性16例，女性10例，平均年齡為52.16±11.82歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器與試劑 購(gòu)自美國(guó)BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀及購(gòu)自BD公司的抗人CD4、γ-干擾素、IL-17和IL-22抗體的檢測(cè)試劑；Hyelone公司提供的完全培養(yǎng)基RPMI 1640；淋巴細(xì)胞刺激液[離子霉素和佛波酯(美國(guó)eBioscience公司)、布雷菲德菌素 A(美國(guó) BD公司)]；γ-干擾素、IL-17和IL-22檢測(cè)的ELISA試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司以及由上?？迫A提供的ST360酶標(biāo)儀；采用羅氏Cobas e601化學(xué)發(fā)光儀及原裝配套檢測(cè)試劑。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)Thl、Th17和Th22細(xì)胞亞群比例 取500μl全血和500μl 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)混勻，加入淋巴細(xì)胞刺激混合液3μl（含佛波酯、離子霉素和布雷菲德菌素A），37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。取上述培養(yǎng)標(biāo)本200μl，加入 CD4 抗體充分混勻，4℃避光 30min。加入500μl固定通透液，充分混勻，4℃避光，20min；1250r/min離心5min，棄上清液，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫避光溫育10min。1250r/min離心5min，棄上清液加人700μl通透液充分混勻，4℃，避光，10min，1250r/min 離心 5min，棄上清液，加入γ-干擾素、IL-17和 IL-22抗體，充分混勻，4℃，避光，30min加入700μl通透液洗，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用Flow Jo7.6.1軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 γ-干擾素、IL-17、IL-22、AFP、CEA、CA199、CA125的檢測(cè) γ-干擾素、IL-17和IL-22分別采用美國(guó)Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司 ELISA 試劑盒檢測(cè)；AFP、CEA、CA199、CA125均采用羅氏Cobas e601化學(xué)發(fā)光儀及配套檢測(cè)試劑檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析各組間差異，采用Spearman檢驗(yàn)分析Th22細(xì)胞頻數(shù)與相關(guān)臨床項(xiàng)目的相互關(guān)系；P值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Thl細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞在各組外周血中頻數(shù)分布比較 HCC組和CHB組患者Thl細(xì)胞頻數(shù)分別為15.61%±8.86%和17.91%±8.91%，均明顯低于健康對(duì)照組的21.95%±8.07%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）；而HCC組與CHB組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HCC組Thl7細(xì)胞頻數(shù)為3.01%±1.29%，健康對(duì)照組為2.05±0.89%，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；CHB組患者Thl7細(xì)胞頻數(shù)為2.21±1.03%，與健康對(duì)照組的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；同時(shí)HCC組與CHB組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HCC組和CHB組患者Th22細(xì)胞頻數(shù)分別為 1.72%±0.82%和 1.36%±0.78%，較健康對(duì)照組的0.96%±0.51%明顯升高(P值均＜0.05)；HCC組與CHB組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見(jiàn)圖 1。

圖 1 Thl、Th17 和 Th22 在各組外周血中的頻數(shù)分布

2.2 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較 γ-干擾素在HCC組、CHB組血漿水平為(19.16±8.68)pg/ml、(25.56±9.98)pg/ml， 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），且均高于健康對(duì)照組的(12.89±6.58)pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P值均＜0.05）。IL-17在HCC組、CHB組血漿水平分別為(69.91±32.01)pg/ml、(63.13±31.73)pg/ml，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均高于健康對(duì)照組的(48.97±23.69)pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值均＜0.05）。IL-22在HCC組、CHB組血漿水平分別為(35.67±23.21)pg/ml、（24.06 土 12.99）pg/ml，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＜0.05）；均高于健康對(duì)照組的（14.99 士 8.49）pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。 見(jiàn)表 1。

2.3 肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞與Thl、Th17細(xì)胞亞群表達(dá)頻數(shù)的相關(guān)性 HCC患者外周血中Th22細(xì)胞頻數(shù)與 Thl7細(xì)胞頻數(shù)呈正相關(guān) (r=0.639，P=0.013）。而Th22細(xì)胞頻數(shù)與Thl細(xì)胞頻數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.078，P=0.717)。 見(jiàn)圖 2。

表1 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較（)

表1 γ-干擾素、IL-17和IL-22在各組血漿中水平比較（)

注：與對(duì)照比較：*P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CHB組比較：△P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 例數(shù)（n）HCC組CHB組對(duì)照組38 45 26 γ-干擾素(pg/ml)19.16±8.68*25.56±9.98*12.89±6.58 IL-17(pg/ml) IL-22(pg/ml)69.91±32.01*△63.13±31.73 48.97±23.69△35.67±23.21*24.06土12.99*14.99士8.49

圖2 肝細(xì)胞癌（HCC）外周血中Th17頻數(shù)與Th22頻數(shù)表達(dá)的相關(guān)性

2.4 肝細(xì)胞癌組Th22細(xì)胞頻數(shù)與IL-22血漿水平、血漿腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22血漿水平存在明顯正相關(guān)（r=0.338，P=0.023），而 Th22 細(xì)胞頻數(shù)與腫瘤標(biāo)志物 AFP、CEA、CA199、CA125均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 HCC組Th22細(xì)胞與血漿IL-22、血漿腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析（n=38）

2.5 肝細(xì)胞癌組中HBV攜帶者與未攜帶者Th22頻數(shù)、IL-22水平比較 HBV攜帶肝細(xì)胞癌患者與HBV未攜帶肝細(xì)胞癌患者外周血Th22頻數(shù)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.602，P=0.025）；HBV攜帶肝細(xì)胞癌患者與HBV未攜帶肝細(xì)胞癌患者外周血IL-22水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （r=0.574，P=0.038）。

3 討論

Th22細(xì)胞是學(xué)者們最近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞功能亞群，其表達(dá) CCR6、CCR4和 CCRl0，是僅以產(chǎn)生IL-22為主，但是不產(chǎn)生IFN、IL-4和IL-17，是獨(dú)立于Thl、Th2和Th17的一類(lèi)細(xì)胞亞群。Th22細(xì)胞由Duhen等[4]和 Trifari等[5]最早于2009年發(fā)現(xiàn)的，是一類(lèi)與皮膚免疫功能存在密切關(guān)系的CD4+T細(xì)胞功能亞群，其功能主要是通過(guò)IL-22發(fā)揮作用。IL-22屬于IL-10細(xì)胞因子家族，主要由Th22細(xì)胞和Thl7細(xì)胞亞群產(chǎn)生，其中Th22細(xì)胞分泌量可占總IL-22分泌量的65%左右；IL-22介導(dǎo)其影響通過(guò)異源二聚體跨膜受體復(fù)合物組成IL-22R1和IL-10R2，隨后激活Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號(hào)通路，包括STAT3的JAK1和TYK2[6]。STAT3磷酸化、下游基因Bcl-2和Bcl-XL上調(diào)、細(xì)胞周期蛋白D1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)均促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。STAT3介導(dǎo)的T細(xì)胞擴(kuò)張和Thl7細(xì)胞的增殖是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵[8]。在肝臟STAT3被激活后會(huì)誘導(dǎo)抗菌蛋白因子、急性時(shí)相因子、凋亡抑制因子和增值相關(guān)因子等的表達(dá)，因此我們都認(rèn)為IL-22有表現(xiàn)為保護(hù)肝臟、促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂、甚至是促進(jìn)腫瘤形成等作用[9-11]。IL-22的作用受體廣泛分布于皮膚、肝臟、腎臟、呼吸道及消化道等組織細(xì)胞中，主要是通過(guò)對(duì)組織細(xì)胞的作用來(lái)參與這些系統(tǒng)疾病的病理發(fā)生過(guò)程[12]。IL-22在皮膚的防御中發(fā)揮著重要的作用，并且在病毒和真菌感染中也起著相應(yīng)作用；除感染性疾病外，IL-22在自身免疫性疾病，如銀屑病、Crohn'S疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中表達(dá)水平均有所上調(diào)。Jiang等的研究顯示，肝癌微環(huán)境中高表達(dá)的IL-22會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移通過(guò)STAT3的活化[13]?？佃14]等研究表明在慢性肝病和肝硬化患者中Th22細(xì)胞血漿表達(dá)水平明顯增高，提示Th22細(xì)胞及效應(yīng)分子參與了慢性肝炎肝硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，進(jìn)一步推測(cè)肝細(xì)胞癌和慢性肝病發(fā)生的T細(xì)胞介導(dǎo)中與Th22細(xì)胞的免疫效應(yīng)可能相關(guān)。在我們的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組、慢性乙型肝炎組中外周血Th22頻數(shù)和IL-22血漿水平均顯著高于健康對(duì)照組，更重要的是，我們還觀察到血清IL-22水平與HCC患者中Th22細(xì)胞頻數(shù)相關(guān)，我們由此推測(cè)，Th22細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-22促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制。

目前Th22細(xì)胞在肝癌中的研究還不多見(jiàn)，僅有許秀華[15]等研究認(rèn)為T(mén)h22細(xì)胞與Th1、Th17和Treg細(xì)胞一樣均參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)病進(jìn)展，外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)表達(dá)與肝腫瘤直徑呈正相關(guān)。但Th22細(xì)胞與IL-22在其他腫瘤中的研究有相關(guān)報(bào)道，Sun等[16]的研究認(rèn)為在直腸癌中Th22細(xì)胞可通過(guò)影響STAT3信號(hào)通路而控制結(jié)腸腫瘤的增長(zhǎng)速度，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；雷波等[17]的研究認(rèn)為T(mén)h22細(xì)胞和IL-22在卵巢癌組織呈高水平表達(dá)，且與腫瘤分期呈正相關(guān)；另外Th22細(xì)胞及其效應(yīng)分子在肺癌、宮頸癌、胰腺癌中的作用也有相關(guān)的報(bào)道。

有研究已證實(shí)HCC發(fā)病及進(jìn)展中也存在其他CD4+T細(xì)胞亞群或相關(guān)細(xì)胞因子失衡。Thl細(xì)胞主要發(fā)揮抑制腫瘤的作用，HCC患者早期癌組織與外周血Th1細(xì)胞頻數(shù)表達(dá)明顯升高，而中晚期出現(xiàn)下降。本研究發(fā)現(xiàn)HCC外周血Th1細(xì)胞頻數(shù)均低于健康對(duì)照者和CHB組，主要考慮是因?yàn)镠CC患者病例以晚期占多數(shù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者Th17細(xì)胞頻率也明顯高于健康對(duì)照組，且HCC患者外周血中Th22細(xì)胞與Thl7細(xì)胞頻數(shù)呈正相關(guān) (r=0.639，P=0.013），提示Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中的有協(xié)同效應(yīng)，但其協(xié)同效應(yīng)仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。有試驗(yàn)者將猿人類(lèi)免疫缺陷病毒 （SHIV）感染獼猴后，發(fā)現(xiàn)在SHIV慢性感染后再次感染瘧疾時(shí)Th22細(xì)胞的表達(dá)水平較SHIV與瘧疾共同感染時(shí)高出200多倍，并與其預(yù)后明顯有關(guān)[18]，由此推測(cè)Th22表達(dá)水平與病毒感染存在一定的相關(guān)性；與本研究中CHB組Th22細(xì)胞頻數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，HBV攜帶肝細(xì)胞癌患者Th22細(xì)胞頻數(shù)明顯高于HBV未攜帶肝細(xì)胞癌患者相一致。雖然Th22細(xì)胞有促進(jìn)再生的作用，但我們實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)與診斷HCC再生的經(jīng)典指標(biāo)—AFP有明顯相關(guān)性，這可能與兩者刺激分泌的路徑不同有關(guān)。

Th22細(xì)胞及其效應(yīng)分子參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)病發(fā)展過(guò)程，為肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供新的線索，未來(lái)更多的研究探討Th22細(xì)胞與肝內(nèi)微環(huán)境間的相關(guān)作用，為促進(jìn)輔助性T細(xì)胞亞群及相關(guān)因子在肝細(xì)胞癌中的免疫治療發(fā)展提供依據(jù)。