miR-451在缺血性腦卒中表達的相關(guān)性研究

王蒙蒙 白 鷹△ 郎明非

1)大連大學附屬新華醫(yī)院，遼寧 大連 116021 2)大連大學醫(yī)學院，遼寧 大連 116622

腦卒中是導致死亡和嚴重的長期殘疾的主要原因[1-3]。目前，該病的診斷主要依賴于臨床癥狀和神經(jīng)影像學技術(shù)[4-5]。然而在實際的臨床工作中仍存在一定的局限性，使得缺血性腦卒中在發(fā)病后沒有被識別。因此迫切需要提高缺血性腦卒中診斷的速度和準確性。通過外周血檢測生物指標，是一種無創(chuàng)或較小創(chuàng)傷的疾病診斷方法。此方法不僅可以快速的診斷疾病的發(fā)生，同時還可減輕病患疼痛[6-7]。與此同時，外泌體源性miRNA作為近年的研究熱點之一，在腦卒中相關(guān)方面的研究有了突破性的的進展。

外泌體最早在1983年被提出，PAN等[8-9]在紅細胞上清液的研究過程中發(fā)現(xiàn)囊狀小泡的存在。目前關(guān)于外泌體的認識更加深入，隨著機體病理生理的改變，外泌體中包含大量的、種類繁多的miRNA、mRNA、siRNA等生物活性物質(zhì)也隨之發(fā)生相應的變化[10-11]。越來越多的實驗研究證明，外泌體源性miRNA多方面影響著腦血管以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展，在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。其中較為顯著的發(fā)現(xiàn)是，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中存在外泌體源性miRNA表達水平的特異性改變[14-16]。由此可見外泌體源性miRNA 作為生物標志物用于診斷和預后具有很大的潛能。因此本研究選取外泌體源性miR-451作為研究對象，探索其作為缺血性腦卒中臨床診斷標志物的可能性。

1 資料與方法

1．1一般資料收集2017-5—2018-05大連大學附屬新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的缺血性腦卒中患者的血液標本30例，男14例，女16例。納入標準：(1)缺血性腦卒中的診斷符合2014 年中華醫(yī)學會缺血性腦血管病診療指南的標準；(2)患者發(fā)病24 h 內(nèi)入院，且未行機械取栓或動靜脈溶栓治療。排除標準：(1)既往有腦卒中史；(2)合并嚴重心、肝、腎疾病及腫瘤等。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會同意，且參與者均簽署知情同意書。

1．2方法

1．2．1 血清中外泌體的分離：用miRNaeasy Serum/Plasma Kit(購于QIAGEN 公司)方法提取血清中的外泌體，通過Trizol(購于Takara 公司)的方法，裂解外泌體并提取其中全部的RNA，去除RNA 中的gDNA，以PrimeScriptTM RT reagent kit(購于Takara 公司)逆轉(zhuǎn)錄全部RNA 為cDNA。反應條件：42 ℃孵化15 min，85 ℃孵化5 s。

1．2．2 miR-451表達的檢測：通過SYBR 熒光(購于Takara 公司)實時定量PCR 技術(shù)，按照試劑盒說明書的反應體系，檢測血清外泌體中miR-451 的表達。采用兩步法的反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；溶解曲線。CEL-39 作為內(nèi)參對照。并使用2-△△Ct方法計算各組中miR-451 的表達量。

2 結(jié)果

2．1不同組間患者基本資料的比較患者的臨床基線特征，如年齡、性別、糖尿病、高血壓、高血脂等比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2．2不同組間血清外泌體中miR-451表達比較相對于對照組，缺血性腦卒中患者發(fā)病后1 d與7 d組血清外泌體中miR-451的表達顯著升高，相對表達量分別為1.07±0.45，19.74±14.53，17.31±11.36。見圖1。

2．3血清外泌體中miR-451作為缺血性腦卒中臨床診斷標志物的價值ROC曲線分析結(jié)果顯示，缺血性腦卒中發(fā)病后1 d組血清外泌體中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相對表達值1為截斷點，靈敏度為100%，特異度為100%。缺血性腦卒中發(fā)病后7 d組，血清外泌體中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相對表達值1為截斷點，靈敏度為100%，特異度為100%。見圖2。

3 討論

腦卒中是我國第三大常見的死亡原因，也是世界范圍內(nèi)最常見的致殘原因。而缺血性腦卒中是最常見類型[17-18]。其準確的臨床診斷一直是臨床醫(yī)生十分關(guān)注的問題。雖然當前關(guān)于缺血性腦卒中的醫(yī)學影像技術(shù)在不斷的發(fā)展，但因最新的成像技術(shù)操作復雜及費用高昂而在某種程度上未做到完全普及[19-21]。此外，影像學檢查對于區(qū)分陳舊性缺血灶和新發(fā)缺血灶存在著一定的局限性。相對而言，血液標志物檢測具有非創(chuàng)傷性、快速及經(jīng)濟等優(yōu)點，有希望通過尋找到有效的生物標志物，應用于各種疾病的診斷或預后判斷等。外泌體可廣泛的分布于人體各種體液中，在血液、尿液、唾液等均可被檢測[22]。外泌體在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用，廣泛參與人體的各種生理和病理進展。缺血性腦卒中發(fā)生后，外泌體可以被合成并從腦卒中反應細胞中釋放出來，能夠通過血腦屏障，可以在外周血或腦脊液中檢測到，反映腦卒中病理進展[23]。此外，外泌體具有相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以保護其內(nèi)容物免受破壞，因此可以通過檢測所攜帶的核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等多種生物成分來判斷疾病的狀態(tài)，是一種可靠的潛在生物標志物[24-25]。實驗研究證明，外周血中的miRNA主要被包裹于外泌體中，可作為一項重要的觀察指標[26]。在缺血性腦卒中發(fā)生后，會有多種外泌體源性的miRNA發(fā)生變化，或上調(diào)或下調(diào)，其表達水平與疾病病理生理學相關(guān)[27-28]。然而針對缺血性腦卒中診斷的血液外泌體源性miRNA標志物尚不清楚。

在生物體中，DNA首先編碼生成pre-miRNA，經(jīng)過一系列的酶切過程形成20nt左右的單鏈RNA即miRNA，與AGO結(jié)合形成有活性的RISC[29-30]。與mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)的2-8個堿基互補，成為種子區(qū)域，依據(jù)互補的完全性在翻譯過程分別引起mRNA降解或多肽鏈的脫落[31-33]。在針對腦卒中患者的研究中，據(jù)報道大概有超過20%的腦卒中存在miRNA的變化，因此研究者認識到miRNA與腦卒中之間有著緊密的聯(lián)系，進而開展了大量的實驗研究，并得到客觀的研究成果。

表1 2組基本資料比較Table 1 Comparison of basic data between two groups

注：A：缺血性腦卒中發(fā)病后1 d組外泌體源性miR-451的ROC曲線；B：缺血性腦卒中發(fā)病后7 d組外泌體源性miR-451的ROC曲線

通過創(chuàng)建腦卒中模型進行實驗發(fā)現(xiàn)，較假手術(shù)組，模型構(gòu)建24 h后血清中的miR-124濃度升高150倍?？芍X卒中疾病發(fā)生后miR-124具有含量豐富的特點[34-35]。而且還有實驗表明，miR-124還有可能作為顱腦損傷嚴重程度分型的標志物[36-38]。所以，作為一種生物標記，miR-124有很大的研究價值。此外，經(jīng)證實，不同的miRNA在腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中起著不同的功能作用。在缺血性腦提取物中發(fā)現(xiàn)，骨髓干細胞分泌的外泌體大量增加，攜帶的miR-133b被輸送到星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，增加軸突生長[39]；DA等[40]通過甲酚紫染色證明mir-122能明顯的減小腦卒中的梗死面積，以及改善小鼠的生物學行為；用去除膠實驗和錯步實驗來分析功能恢復情況，通過實驗組和對照組之間的比較發(fā)現(xiàn)miR-133b很大程度提高了神經(jīng)恢復[41]。

關(guān)于miR-451的研究發(fā)現(xiàn)，其與缺血、神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著緊密的聯(lián)系。在低壓低氧的模型中，經(jīng)證實血清中miR-451的表達明顯上調(diào)[42]。在心肌細胞缺血再灌注性損傷模型中，miR-451通過抑制HMGB1 mRNA增加心肌細胞的存活率、降低凋亡率[43-45]。與此同時，miR-451可通過下調(diào)Rac-1基因的表達，調(diào)節(jié)急性缺血引起的氧自由基的生成[46-47]。此外，在肺缺血再灌注模型中，miR-451的下調(diào)可促進AKT信號通路的激活，進而減少細胞凋亡，起到對肺組織的保護作用[48-49]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，目前已知miRNA-451靶向調(diào)控p38MAPK，減輕腦微血管損傷、促進血管再生以及調(diào)節(jié)炎癥反應[50]；關(guān)于miRNA-451在疾病中的表達，一方面，在外傷性路腦損傷時，miRNA-451的表達升高[51]；另一方面，miRNA-451有希望成為腦卒中后認知障礙的一種分析指標[52]。然而關(guān)于miRNA-451作為缺血性腦卒中的生物標志物的可能性目前仍不清楚。

因此，我們探索了外周血外泌體源性的miR-451在缺血性腦卒中的潛在預測價值。在本研究中，我們分析了來自缺血性腦卒中患者和對照組的血液標本，由圖1可知，缺血性腦卒中的發(fā)病前后，外泌體源性miR-451的表達水平發(fā)生了變化。與對照組相比，缺血性腦卒中發(fā)病后，外泌體源性的miR-451表達顯著增加。此外，本研究分別計算缺血性腦卒中患者發(fā)病后第1天和第7天的ROC曲線，AUC均為1，表明人群中100%受試者被正確診斷，可見血清外泌體源性的miR-451有可能是一種優(yōu)秀的缺血性腦卒中臨床診斷的生物標志物。

但由于本研究選取的樣本容量較少，如需廣泛的應用于臨床工作中，尚需更大規(guī)模的臨床試驗研究進行更深入的探討，明確外周血外泌體中miR-451作為缺血性腦卒中的臨床診斷指標的可能性。另一方面，本研究選取了缺血性腦卒中發(fā)病后的1天和7天兩個時間點，這兩個時間點中外周血外泌體中miR-451的表達無統(tǒng)計學意義，而在這段時間中miR-451的表達情況仍需進一步的深入探索。