HPLC-MS/MS法測定人血漿中伏立康唑濃度的不確定度評價

于思源 馮志平

(江門市中心醫(yī)院藥學(xué)部，中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院，江門 529000)

不確定度的定義為表征合理地賦予被測量之值的分散性，廣義而言，意為對測量結(jié)果正確性的可疑程度。不確定度的評定方法通常有A和B兩種，A類評定是由一系列重復(fù)觀測值計算得到，而B類評定是根據(jù)有關(guān)信息(假定的概率密度函數(shù))來評定[1]。伏立康唑作為新一代三唑類廣譜抗真菌藥廣泛用于治療血液病、移植或免疫缺陷患者的侵襲性真菌感染[3-4]。由于伏立康唑主要通過細(xì)胞色素P450同工酶2C19酶(CYP2C19)代謝，該酶活性存在顯著的個體和種族差異，表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性[5-7]；不同人群間病理生理差異等也可能使伏立康唑體內(nèi)藥動學(xué)特征產(chǎn)生較大差異，從而導(dǎo)致個體間血藥濃度偏差較大，濃度過高易發(fā)生不良反應(yīng)(ADR)，而濃度過低則導(dǎo)致臨床治療失敗。研究表明伏立康唑的血藥濃度與臨床療效、ADR的關(guān)系密切[8]。因此濃度檢測的準(zhǔn)確性是準(zhǔn)確調(diào)整用藥的前提。目前為止，伏立康唑液質(zhì)聯(lián)用測定方法的不確定度尚未見文獻報道，為了評估測定方法的準(zhǔn)確性，改進實驗步驟，提高檢測質(zhì)量，本文根據(jù)相關(guān)的規(guī)范和指南[1-2]并參考相關(guān)文獻[9-12]，對HPLC-MS/MS測定人血漿中伏立康唑濃度的不確定度進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀、6460C三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Aglient科技公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；XSE205DU型電子分析天平，瑞士Mettler公司；GenPure，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試藥

伏立康唑?qū)φ掌?批號：81607441，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.50%，珠海麗珠制藥廠)；氯雷他定對照品(內(nèi)標(biāo)，批號：DC-0201-1503002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.80%，浙江東亞藥業(yè)股份有限公司)；乙腈和甲醇均為色譜純，Thermo Fisher Scientific公司；甲酸為色譜純，Dikma Technologies公司；甲酸銨為色譜純，Sigma-Aldrich公司。方法學(xué)研究所用健康人空白血漿，由江門市中心醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(50mm×4.6mm, 1.8μm)；流動相比例為乙腈：含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸銨水溶液(85:15)，等度洗脫2.5min，流速為0.4mL/min，柱溫為40℃，進樣量為1μL。

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子MRM模式，質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓4000V，干燥氣流速11L/min，霧化氣壓力15psi，干燥氣溫度300℃，伏立康唑：碎裂電壓120V，碰撞能量15V，離子對：m/z350.0→280.9；氯雷他定：碎裂電壓140V，碰撞能量20V，離子對：m/z383.0→337.0。

2.2 溶液的制備

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?0.17mg，置于5mL容量瓶中，50%甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為2.02mg/mL的伏立康唑儲備液，置于4℃冰箱中保存，備用。臨用前取伏立康唑儲備液適量，用50%甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、2、5、20、50、100和200μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于5mL容量瓶中；另取伏立康唑儲備液適量，用50%甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、30和160μg/mL的質(zhì)控溶液置于5mL容量瓶中。

精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品11.50mg，置于5mL容量瓶中，50%甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為2.295mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，置于4℃冰箱中保存，備用。臨用前將內(nèi)標(biāo)儲備液用50%甲醇稀釋成濃度為3μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于5mL容量瓶中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品的配置、處理

取95μL空白人血漿，加入伏立康唑系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液各5μL，配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.1、0.25、1.0、2.5、5和10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品及0.025、1.5和8.0μg/mL的質(zhì)控樣品。

精密吸取含藥血漿樣品100μL，加入3μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液5μL，渦旋1min；再加入純乙腈600μL沉淀蛋白，渦旋振蕩3min，15000r/min離心5min，取其上層清液100μL轉(zhuǎn)移至進樣瓶內(nèi)，進樣1μL分析。

2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

以VOR濃度為x軸，以VOR與內(nèi)標(biāo)信號的面積比為y軸，用最小二乘法進行線性回歸，線性回歸方程：y=ax+b，其中：x為VOR濃度，y為VOR與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，a為回歸方程的斜率，b為截距。

2.5 測量不確定度來源分析

分析整個實驗流程，測量不確定度的來源主要有：溫度、重復(fù)性、對照品稱量、工作液配制、樣品制備、基質(zhì)效應(yīng)、樣品提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器允差、對照品純度和樣品不均勻性等因素(圖1)。

2.6 溫度對測定的影響

實驗室溫度控制在(20±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品均在相同溫度下制備和測定，因此溫度引入的不確定度可忽略。

2.7 測量不確定度的評定

2.7.1 重復(fù)性(用A類評定程序)

重復(fù)性引入的不確定度用質(zhì)控樣品重復(fù)測定值評估，低、中、高3個濃度(0.025、1.5和8.0μg/mL)的質(zhì)控樣品各3組(m=3)，每組平行測量5次(n=5)，結(jié)果見表1。用貝塞爾公式計算合并樣品偏差：

圖1 不確定度來源的因果分析圖Fig.1 Causal analysis chart of uncertainty sources

表1 樣品重復(fù)測定數(shù)據(jù)Tab. 1 Repeatability of sample determination

其中：i為組數(shù)，j為每組平行測定次數(shù)(i=3,j=5)。每組5個測定值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

2.7.2 對照品稱量引入的不確定度(用B類評定程序)

對照品稱量引起的不確定度可表示為：

其中，天平的重復(fù)性誤差u(m)在重復(fù)性實驗中已經(jīng)得到評定，不再重復(fù)計算。由自動調(diào)零引起的誤差u(△0)和天平的非線性誤差u(△)按均勻分布，包含因子k=3，隨機變量半寬a=0.5e，依據(jù)計量檢定證書，天平檢定分度值e=0.01mg，則標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

減重對照品稱量時自動調(diào)零作為一次扣皮，則a0=a，u(△0)=a0/k=u(△)=0.0029。天平的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

VOR對照品稱量的質(zhì)量為10.17mg，則VOR對照品稱量相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

內(nèi)標(biāo)(IS)對照品稱量的質(zhì)量為11.50mg，則內(nèi)標(biāo)對照品稱量相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.3 樣品配制引入的測量不確定度(用B類評定程序)

(1)容量瓶引入的測量不確定度：用于儲備液配制的A 級容量瓶(F)規(guī)格為5mL，其最大允許誤差為±0.020mL。由于溫度對定容的影響非常小，忽略不計。按均勻分布，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur=a/(kx)，則：

(2)移液器引入的測量不確定度：本次所用移液器為Eppendorf可調(diào)量程移液器，其中所用的Eppendorf移液器量程為：0.5～10μL(P1)，10～100μL(P2)、100～1000μL(P3)和0.5～5μL(P4)。參照Eppendorf說明書，P1在5μL時最大允差為±1.5%；P2在100μL時最大允差為±0.8%；P3在500和1000μL時最大允差分別為±1%、±0.6%；P4在2～2.5mL時最大允差為±1.2%。按均勻分布，包含因子，則移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度：ur(P1-5)=0.0061，ur(P2-100)=0.0033，ur(P3-500)=0.0033，ur(P3-1000)=0.0024，ur(P4-2.5)=0.0049。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液配制引入的測量不確定度：儲備液配制時的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度已經(jīng)在容量瓶定容中引入，因此可以忽略；在使用儲備液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(STD)時，共使用5mL容量瓶8次；100～1000μL(P3)移液器2次，其中使用500μL 1次，1000μL 1次；0.5～5mL(P4)移液器3次，其中使用2～2.5mL 6次；在使用儲備液配制質(zhì)控溶液(QC)時共使用5mL容量瓶4次，低質(zhì)控2次，中質(zhì)控1次，高質(zhì)控1次；100～1000μL(P3)移液器4次，其中高質(zhì)控使用100～500μL 1次，中質(zhì)控使用500～1000μL 1次，低質(zhì)控使用500～1000μL 2次。查閱相關(guān)文獻[13]，標(biāo)稱容量為介于給定的兩個容量點之間的值，那么它的最大允差是以任一兩個容量之間較大容量為標(biāo)準(zhǔn)的，因此100～500μL的最大允差按500μL計算，500～1000μL的最大允差按1000μL計算，2mL的最大允差按2.5mL計算。內(nèi)標(biāo)配制不影響測定，則對照品溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

(4)含藥標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品配制引入的不確定度：配制含藥標(biāo)準(zhǔn)樣品(S)和質(zhì)控樣品(QC)時，使用10～100μL移液器吸取95μL空白血漿，后使用0.5～10μL移液器吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液或質(zhì)控溶液、內(nèi)標(biāo)溶液各5μL，加入到空白血漿中，后使用100～1000μL移液器加入600μL純乙腈進行樣品提取。因此，所用移液器的型號和次數(shù)均為：0.5～10μL(P1)2次，10～10μL(P2)1次，100～100μL(P3)1次，同上“2.7.3”項“(3)”中最大允差計算原則，則配制含藥標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

則樣品配制過程中引入的相對不確定度為：

該段落第二句是論據(jù)句，它只是呈現(xiàn)了一個事實：歌手龐麥郎以一首《我的滑板鞋》驚醒了很多當(dāng)代人。而通過分析，我們恍然大悟：清醒地與時代保持一段距離其實也是真實地表現(xiàn)時代的聲音，這樣的聲音恰恰贏得時代的共鳴。這樣的論據(jù)雖然只有一個，但很有說服力。很多考生錯誤地認(rèn)為，論據(jù)越多越好，其實不然，精當(dāng)?shù)恼摀?jù)常起到一以當(dāng)十的效果。

2.7.4 基質(zhì)效應(yīng)和蛋白沉淀過程引入的測量不確定度(用A類評定程序)

(1)基質(zhì)效應(yīng)的影響：質(zhì)譜法中，基質(zhì)效應(yīng)(ME)可影響最終的測定結(jié)果，其不確定度必須考慮。評估方法如下：分別用處理后基質(zhì)及空白溶劑配制低、高2個濃度(0.025和8.0μg/mL)質(zhì)控樣品，平行測定5次，計算方法：基質(zhì)效應(yīng)=處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(A)/空白溶劑配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(B)，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的低濃度和高濃度質(zhì)控血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為(90.68±2.94)%及(93.31±3.18)%，則基質(zhì)效應(yīng)ur(5)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

(2)樣品提取過程的影響：

樣品提取過程(RE)同樣會影響測定結(jié)果，其引入的不確定度由樣品提取評估。評估方法如下：以未處理基質(zhì)和處理后基質(zhì)制備低、中、高3個濃度(0.025、1.5和8.0μg/mL)的質(zhì)控樣品，每個濃度平行配制3份，計算方法：樣品提取(%)=100%×血漿配制樣品蛋白沉淀后的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(C)/處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(D)，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的低、中、高濃度質(zhì)控血漿樣品的樣品提取分別為(104.73±10.62)%、(102.47±7.97)%、(94.94±3.67)%，當(dāng)樣本量較小時，樣品提取ur(6)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度使用極差法進行計算[1]，

即：

結(jié)果分別為：ur(RE,L)=6.07%，ur(RE,M)=4.76%，ur(RE,H)=2.31%。

2.7.5 儀器量化引入的測量不確定度(用B類評定程序)

質(zhì)譜儀為Agilent 6460C三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，液相為Agilent 1290 infinity，根據(jù)設(shè)備校準(zhǔn)報告，進樣峰面積重復(fù)性為4.9%，按均勻分布，包含因子，儀器量化相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：ur(7)=2.83%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線包括8個濃度，用VOR峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對VOR濃度進行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，以1/x2作為權(quán)重(w)。標(biāo)準(zhǔn)曲線中VOR與內(nèi)標(biāo)的峰面積比及3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距見表2，用擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出對照品血漿的VOR濃度見表3。

表2 VOR與內(nèi)標(biāo)峰面積比及回歸曲線參數(shù)Tab. 2 Area ratio of VOR with the internal standard and parameters of the calibration curves

標(biāo)準(zhǔn)曲線有8個濃度點，n=8，對照品血漿每個濃度測定的次數(shù)為3次，m=3，N為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的總次數(shù)，N=m×n=24；am為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；xi為第i個標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的濃度，x為8個標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的理論平均值，x=2.3783μg/mL；i為每組對照溶液的序數(shù)(i=1, 2, …,m)，j為測定血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的序數(shù)(j=1, 2 ,3, …,n)。

表3 用擬合曲線計算出每個對照品血漿VOR的濃度Tab. 3 Back-calculated concentrations of VOR in standard plasma samples

自相關(guān)方差為：

殘余標(biāo)準(zhǔn)差為：

測定低、中、高濃度質(zhì)控樣品各15次，P=15，計算得平均濃度：則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

其中，Sxx表示自相關(guān)方差，wi為權(quán)重。var(yobs)表示樣品觀測值方差，計算公式：

其中，S為殘余標(biāo)準(zhǔn)差。u(xL)=0.0082，u(xM)=0.0075，u(xH)=0.0117。則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.7 對照品純度和樣品不均勻性引入的不確定度

伏立康唑?qū)φ掌泛蛢?nèi)標(biāo)氯雷他定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不是100%，限度標(biāo)識可按1%計(假定符合均勻分布)，則相對不確定度為ur(9)=1%/=0.58%；由于樣品均為液態(tài)，使用前混合均勻，由樣品不均勻性引入的不確定度忽略不計。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的合成及擴展

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的合成

依據(jù)不確定度傳播規(guī)律對各相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度進行合成：

則VOR質(zhì)控樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度分別為：

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的擴展

采用簡易評定法，對應(yīng)的置信概率P=95.45%(k=2)，則擴展不確定度分別為：

2.9 測定結(jié)果的表示

當(dāng)置信概率P=95.45%(k=2)，血漿中VOR低、中、高濃度質(zhì)控的測定結(jié)果可以分別表示為(0.025±0.0018)、(1.5±0.2057)和(8±0.8723)μg/mL。

3 討論

本文通過HPLC-MS/MS法測定血漿中伏立康唑濃度的實驗流程，尋找不確定度的來源并計算，對各不確定度分量進行合成并擴展(圖2)。本試驗未考慮溫度引入的不確定度，原因是實驗室溫度控制在(20±2)℃，且標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品幾乎在同一時間配制，溫度變化很小。樣品在制備時均混合均勻，因此樣品不均勻性引入的不確定度可忽略不計。

首先，從計算結(jié)果可知，對照品稱量引入的不確定度很小，與文獻報道類似[9-10]幾乎可以忽略不計，這是因為對照品稱量所用分析天平為十萬分之一級，因此配備高精度的天平可顯著減小對照品稱量引入的誤差；高，中、低質(zhì)控濃度樣品提取引入的不確定度差別很大，尤其是低質(zhì)控的不確定度相對較大，筆者認(rèn)為主要是由于向處理后的基質(zhì)中添加內(nèi)標(biāo)和質(zhì)控工作液時未充分混勻或混勻效果不佳，導(dǎo)致測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差相對較大。因此，筆者建議在向處理后的基質(zhì)中添加內(nèi)標(biāo)或質(zhì)控工作液后，輕微渦旋5～10s，溶液擴散應(yīng)更為均勻，人為操作誤差可能更??；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對低濃度質(zhì)控溶液的影響最大，可能與標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍相對較大，測定點的個數(shù)和重復(fù)測定次數(shù)相對較少密切相關(guān)；液質(zhì)聯(lián)用儀的進樣重復(fù)性引入的不確定度，筆者建議在正式進樣前使用當(dāng)天一批中最低濃度樣品和中等濃度樣本，至少各進3針，可能會有效防止質(zhì)譜信號漂移，減少測量結(jié)果的不確定度。

圖2 不確定度分量的統(tǒng)計條形圖Fig.2 Statistical bar graph of uncertainty components

綜上所述，本文評定了LC-MS/MS法測定人血漿中VOR濃度的不確定度，在低濃度時主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，樣品提取和重復(fù)性引入，在中濃度時主要由樣品提取和儀器允差引起，在高濃度時主要由儀器允差，重復(fù)性和樣品提取引入，另外，依照《中國藥典2015年版生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》，本次研究在考察基質(zhì)效應(yīng)時未將中質(zhì)控溶液納入，因此，基質(zhì)效應(yīng)對中質(zhì)控溶液的影響并未評價。