阿膠類保健食品中阿膠成分和牛皮源成分檢測及質量評價

王超，遲少云，楊釗，祝波，裴琳，徐慧

(青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島，266071)

阿膠是由驢皮經煎煮濃縮而成的固體膠類，具有滋陰補血等功效[1-2]，在中成藥配伍方面也占有重要地位[3]，可做中藥材使用，也可作為功效原料添加到保健食品中，與人參、鹿茸并稱為滋補三寶[4-5]。近年來，驢資源的減少加之利益的驅使，部分不法商販在阿膠藥材及其保健制品中摻入了廉價的劣質皮類膠充數(shù)，甚至完全用劣質皮類膠代替阿膠添加到阿膠藥材及其保健制品中[6]，嚴重損害了合法商家的權益和消費者的切身利益，必須采取強有力的措施嚴加控制。

目前的檢測方法中針對阿膠中藥材的研究較為集中[7-9]，標準也漸成熟?！吨袊幍洹?015年版一部[10]新增了阿膠中藥材中阿膠鑒別項；國家食品藥品監(jiān)督管理局的補充件中[11]規(guī)定了阿膠中藥材中牛皮源的檢測和判定方法，在結果判定時將樣品與牛皮源對照品同步比較，只要m/z641.3(雙電荷)→726.2和m/z641.3(雙電荷)→783.3離子對不同時出現(xiàn)或同時出現(xiàn)，但峰面積均不超過對照品峰面積即可。在中國藥典中，以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸這4種氨基酸含量的總和作為阿膠含量，作為中藥材的阿膠，其主成分阿膠含量應不小于43%[10]；與阿膠中藥材相比，阿膠類保健食品具有形式多樣化、成分構成多樣化的特點，且阿膠原材料僅作為其中的一種功效成分而添加，導致部分類型產品中阿膠的含量是較低的，這種情況下即使在阿膠原材料中摻有大部分的牛皮源成分，也會因生產工藝中稀釋及其他步驟的進行而使得制得的成品類阿膠保健食品中牛皮源含量較低，最終被判定為合格產品。本文采用UPLC-MS/MS法對6種類型、67份市售阿膠類保健食品中阿膠成分和牛皮源成分進行測定，結合阿膠含量[10]、水分[12]、蛋白質[13]含量的測定情況對每種劑型中阿膠成分和牛皮源成分進行分析，以期對阿膠類保健食品的質量控制和專項標準制定提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠類保健食品共6種劑型，包括阿膠片35批、阿膠粉3批、阿膠膠囊3批、阿膠口服液11批、阿膠核桃糕13批、阿膠含片2批。

對照品：牛皮特征肽A(中檢院，批號111941-201202)；阿膠對照藥材粉末(中檢院，批號：121274-201202)；L-羥脯氨酸對照品(中檢院，批號：111578-200201，含量：100%)；甘氨酸對照品(中檢院，批號：140689-201404，含量：99.9%)；丙氨酸對照品(中檢院，批號：140624-200805，含量：100%)；L-脯氨酸對照品(中檢院，批號：140677-201206，含量：100%)；胰蛋白酶(Sigma公司)。

乙腈，色譜純，德國默克；甲酸，色譜純，北京百靈威科技有限公司；醋酸鈉，分析純，上海化學試劑有限公司；碳酸氫銨，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY UPLC/Quattro Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用系統(tǒng)，Waters公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Sartourious BT125D型電子天平，賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 阿膠含量測定

1.3.1.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agela Nenusil AA色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：以乙腈∶0.1 mol/L醋酸鈉(7∶93)溶液為流動相A，以乙腈∶水(4∶1)為流動相B，進行梯度洗脫(0 min：100%A；11 min：93%A+7%B；13.9 min：88%A+12%B；14 min：85%A+15%B；29 min：66%A+34%B；30 min：20%A+80%B；38 min：20%A+80%B；39 min：100%A；45 min；100%A)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：254 nm[10]。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取L-羥脯氨酸對照品0.016 g、甘氨酸對照品0.032 g、丙氨酸對照品0.014 g、L-脯氨酸對照品0.024 g至同一個10 mL量瓶中，用0.1 mol/L的HCl溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液100、200、500、1 000、2 000 μL至10 mL量瓶中，用0.1 mol/L的HCl溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述5種溶液2 mL至5 mL安培瓶中，加HCl 2 mL，150 ℃水解1 h，放至室溫，轉至蒸發(fā)皿中，用10 mL水分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用0.1 mol/L的HCl溶液溶解，轉移并定容至25 mL量瓶中。

1.3.1.3 樣品溶液的制備

阿膠片、阿膠含片、阿膠糕：取樣品20 g，粉碎、研細、充分混勻后備用；阿膠膠囊:取20粒樣品內容物，研細、充分混勻后備用；阿膠粉：取樣品20 g，研細、充分混勻后備用；阿膠口服液：取樣前充分振搖，混勻后備用。阿膠片類樣品：精密稱取0.25 g至25 mL量瓶中,其他幾類樣品：精密稱取2 g至25 mL量瓶中，均加入0.1 mol/L的HCl溶液10 mL，超聲處理30 min，放冷，用0.1 mol/L的HCl溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL至5 mL安培瓶中，與1.3.1.2對照品溶液同法處理。

1.3.2 水分和蛋白質測定

樣品稱樣前處理過程同1.3.1.3，按照《中國藥典》2015年版通則中水分測定法[12]對樣品中水分進行測定；按照凱式定氮法[13]對樣品中蛋白質含量進行測定。

1.3.3 阿膠成分和牛皮源成分測定

1.3.3.1 液-質分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，進行梯度洗脫(0 min：95%A+5%B；11 min：88.5%A+11.5%B；12 min：30%A+70%B；19 min：30%A+70%B；20 min：95%A+5%B；23 min：95%A+5%B)；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL[11]。

電噴霧離子源，在ESI+模式下采集數(shù)據(jù)，經調諧確定質譜參數(shù)如下：毛細管電壓5.0 kV，萃取錐孔電壓5 V，RF Lens2.0 V，源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣為氮氣，流量為50 L/h，碰撞氣為高純氮氣，多反應監(jiān)測(MRM)模式下檢測。選擇m/z539.8(雙電荷)→612.4和m/z539.8(雙電荷)→923.8為阿膠檢測離子對[9]，選擇m/z641.3(雙電荷)→726.2和m/z641.3(雙電荷)→783.3為牛皮源檢測離子對[10]。

1.3.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取阿膠對照藥材0.1 g和牛皮特征肽A 0.1 g置同一個50 mL量瓶中，加1 g/100 mL的NH4HCO3溶液30 mL，超聲處理40 min使溶解，并用1 g/100 mL的NH4HCO3溶液定容至刻度，搖勻，過0.22 μm的濾膜，即得。精密量取過濾后的對照品溶液1 mL置液相小瓶中，精確加入1 mg/mL的胰蛋白酶溶液200 μL，37 ℃恒溫酶解12 h，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定[11]。

1.3.3.3 樣品溶液的制備

樣品稱樣之前的處理過程同1.3.1.3，精密稱取上述樣品各0.1 g至50 mL量瓶中，加1 g/100 mL的NH4HCO3溶液30 mL，超聲處理40 min,使膠類成分充分溶解，與對照品溶液同法制備并測定[11]。

2 結果與分析

2.1 阿膠含量、蛋白質含量和水分測定

阿膠中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸4種氨基酸含量測定圖譜見圖1。

1-L-羥脯氨酸；2-甘氨酸；3-丙氨酸；4-L-脯氨酸

圖1 阿膠中4種主要氨基酸含量測定色譜圖

Fig.1 The chromatograms of 4 main amino acids in donkey-hide gelatin

按照1.3.1和1.3.2的方法對6種劑型的阿膠類保健食品中阿膠含量、蛋白質含量和水分進行測定,結果見表1。

表1 阿膠類保健食品中阿膠含量和蛋白質含量測定結果

注：阿膠含量為L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4種氨基酸含量的總和。

阿膠片中以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸代表的阿膠含量在39%～65%,蛋白質含量在68%～84%，主成分含量較高[14]，與阿膠中藥材的含量相近。阿膠粉、阿膠膠囊和阿膠含片中，以4種氨基酸代表的阿膠含量差異較大，與阿膠片相比數(shù)值較低，蛋白質含量也較低，且該種測定條件下所測得的氨基酸和蛋白質來源除阿膠原材料外還有其他的配方原料，因此實際的阿膠來源的4種氨基酸代表的含量會更低。阿膠口服液中阿膠含量和蛋白質含量均較低，與產品的劑型有一定的關系，該類產品屬于液態(tài)保健食品，樣品中水分的含量較高，在72%～78%范圍內。阿膠核桃糕的配比原材料中含有阿膠[2]、黃酒、芝麻[15]、核桃[16]、大棗[17]等,成分較為復雜，以1.3.1和1.3.2方法進行的測定結果可以對阿膠核桃糕的綜合營養(yǎng)成分進行評價，以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸代表的含量在9%～21%，但因阿膠核桃糕成品中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸4種氨基酸的溯源性未知，所得測定結果不適合說明阿膠口服液中的阿膠含量，專項測定方法有待繼續(xù)研究。

2.2 阿膠成分和牛皮源成分測定

2.2.1 方法精密度實驗

取處理后的對照品溶液按1.3.3方法進行測定，總離子流圖見圖2，連續(xù)測定6次，阿膠檢測離子對的2個特征峰保留時間的平均RSD為0.3%；牛皮源檢測離子對的2個特征峰保留時間的平均RSD為0.4%，精密度較好。

1-牛皮源成分特征峰；2-阿膠成分特征峰

圖2 阿膠成分特征峰與牛皮源成分特征峰的多反應監(jiān)測總離子流圖

Fig.2 Total ion chromatograms of MRM of donkey-hide gelatin and bovine-hide gelatin

2.2.2 方法穩(wěn)定性實驗

取處理后的對照品溶液按1.3.3方法，分別在制備完成后0、2、4、8、16、24 h進行測定，阿膠檢測離子對的2個特征峰保留時間的平均RSD為0.4%；牛皮源檢測離子對的2個特征峰保留時間的平均RSD為0.4%，穩(wěn)定性較好。

2.2.3 方法檢出限實驗

取處理后的對照品溶液按1.3.3方法測定，以3倍信噪比計算檢出限，牛皮源成分的檢出限為9 μg/g；阿膠成分的檢出限為42 μg/g。

2.2.4 樣品中阿膠成分和牛皮源成分測定

通過1.3.3方法對6種類型共計67份阿膠類保健食品進行測定，樣品中阿膠成分和牛皮源成分測定的總離子流圖見圖3，測定結果見表2。本次測定共計65批合格產品：這些產品中只檢出阿膠成分特征峰的有37批，該種產品生產所用的原材料中并未摻入牛皮源成分；產品中檢出牛皮源成分特征峰，但并未超過標準規(guī)定的有22批，該種產品生產所用的原材料中可能摻入牛皮源成分，一種情況是阿膠原材料中牛皮源成分的摻入比例較低，不超過標準規(guī)定，另一種情況是阿膠原材料中牛皮源成分的摻入比例較高，但隨著其他原材料和輔料的添加牛皮源成分被稀釋，最終在成品中含量不超過標準的規(guī)定。本次測定中檢出牛皮源成分特征峰且超過標準規(guī)定的有2批，即不合格產品，均為阿膠片類型。阿膠成分特征峰和牛皮源成分特征峰均未檢出的有6批，主要為阿膠口服液和阿膠核桃糕2種類型。

1-牛皮源成分特征峰；2-阿膠成分特征峰

圖3 樣品中阿膠成分特征峰與牛皮源成分特征峰的多反應監(jiān)測總離子流圖

Fig.3 Total ion chromatograms of MRM of donkey-hide gelatin and bovine-hide gelatin in samples

表2 阿膠類保健食品中阿膠成分和牛皮源成分測定結果

Table 2 Results of determination of donkey-hide gelatin and bovine-hide gelatin in health-care food of donkey-hide gelatin

樣品僅檢出阿膠成分特征峰(批)僅檢出牛皮源成分特征峰(批)均檢出(批)均未檢出(批)牛皮源超過標準規(guī)定(批)牛皮源成分檢出率/%阿膠片(n=35)27260222.8阿膠粉(n=3)2010033.3阿膠膠囊(n=3)1020066.6阿膠口服液(n=11)3233041.6阿膠核桃糕(n=13)3163053.8阿膠含片(n=2)1010050.0

3 討論

本文對67批市售的阿膠類保健食品中阿膠成分、牛皮源成分、以4種氨基酸代表的阿膠含量、蛋白質含量均進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)：與阿膠片相比，其他5種類型的阿膠類保健食品中阿膠含量和蛋白質含量明顯較低，這與保健食品的生產工藝及產品配方有著十分密切的關系。以4種氨基酸代表的阿膠含量雖然可以從一定程度上反映出阿膠類保健食品中阿膠原材料的含量，但由于保健食品成品在生產過程中原材料種類較多，這4種氨基酸的溯源性有待進一步研究。

阿膠成分和牛皮源成分的測定結果中，阿膠片類型的保健食品中牛皮源成分的檢出率與其他5種類型的保健食品相比較低，但是本次試驗中只在阿膠片類保健食品中發(fā)現(xiàn)了牛皮源成分峰面積超過標準規(guī)定的對照品中牛皮源成分峰面積的樣本。一方面是由于阿膠片的各項指標測定結果均與中國藥典中規(guī)定的標準要求較為一致，所以采用阿膠中藥材的牛皮源限值標準來要求阿膠片時有利于發(fā)現(xiàn)問題并促進產品質量提高；另一方面，本試驗的測定結果可以反映出其他5種類型的保健食品成品中，未發(fā)現(xiàn)牛皮源成分檢出且峰面積超過標準規(guī)定的峰面積的情況，但其生產所用的阿膠原材料中牛皮源的摻入量卻無法體現(xiàn)。根據(jù)市場上現(xiàn)有的阿膠類保健食品的劑型區(qū)別制定牛皮源限值標準是下一步研究的方向。