重組大腸桿菌全細(xì)胞合成D-苯基乳酸

鮑志偉，蘇曉，楊柳婷，陳耀，羅希，付永前,孫小龍

(臺(tái)州學(xué)院 生物質(zhì)資源研究所，浙江 臺(tái)州，318000)

苯基乳酸(phenyllactic acid, PLA)即2-羥基-3苯基丙酸，分子式為C9H10O3，相對(duì)分子質(zhì)量為166，第2位碳原子為手性碳原子，因此具有2種對(duì)映異構(gòu)體，包括D-和L-苯基乳酸[1]。

圖1 D-苯基乳酸(a)和L-苯基乳酸(b)

Fig.1 D-phenyllactic acid (a) and L-phenyllactic acid (b)

苯基乳酸是一種天然有機(jī)酸，廣泛存在于蜂蜜和乳酸菌發(fā)酵品干酪中，對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒無(wú)害。對(duì)酸和熱的穩(wěn)定性好，熔點(diǎn)為121～125 ℃，且親水性大，能在食品體系中均勻擴(kuò)散[1]。苯基乳酸有著明顯的抑菌作用，抑菌譜廣，對(duì)大多數(shù)微生物均有抑制作用，尤其是多種食源性致病菌[2-5]。苯基乳酸不僅是一種理想的新型食品防腐劑[6]，還在飼料添加劑[7]、醫(yī)藥[8-11]、化妝品[12]等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。

有研究表明D型苯基乳酸抑菌效果強(qiáng)于L型苯基乳酸[1]。并且在很多細(xì)菌內(nèi)包括乳酸菌內(nèi)(例如植物乳桿菌)存在2種乳酸脫氫酶，D-乳酸脫氫酶(D-LDH)和L-乳酸脫氫酶(L-LDH)，其中D-LDH對(duì)苯丙酮酸鈉(sodium phenylpyruvat, PPA)的比活力是L-LDH比活力的3倍[13]。RODRIGUEZ等[14]以植物乳桿菌CECT-221為生產(chǎn)菌株，以苯丙氨酸為底物生產(chǎn)苯基乳酸，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在2 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)158 h，產(chǎn)量由原來(lái)的0.23 g/L上升到0.7 g/L。由植物乳桿菌轉(zhuǎn)化苯丙氨酸生產(chǎn)苯基乳酸周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、發(fā)酵液成分復(fù)雜，不利于后續(xù)分離純化；而大腸桿菌代謝路徑清晰，培養(yǎng)周期短，因此選擇重組大腸桿菌，以苯丙酮酸鈉(PPA)為底物，利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸。

1 材料和方法

1.1 菌種

重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-ldhD，臺(tái)州學(xué)院生物質(zhì)資源研究所保藏。

1.2 材料與試劑

葡萄糖、NaCl、KH2PO4、K2HPO4購(gòu)于廣東汕頭市西隴化工廠；酵母膏、蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；苯基乳酸、苯丙酮酸鈉購(gòu)于阿拉丁試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與分析儀器

CHA-SA氣浴恒溫振蕩器(上海江星儀器有限公司)；SBA-40C生物傳感儀(山東微生物研究所)；BSA224S 電子天平(賽多利斯公司)；高效液相色譜儀(島津LC-20A)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 重組大腸桿菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

按1%的接種量接種重組大腸桿菌，LB培養(yǎng)基(酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃，滅菌20 min，250 mL搖瓶分裝50 mL)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1.0 mmol/L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h；誘導(dǎo)后的菌液4 ℃、6 000 r/min離心10 min，再用生理鹽水洗滌2次，最后重懸于轉(zhuǎn)化液(含9 g/L底物PPA、50 mmol/L磷酸緩沖液)中，置于37 ℃、200 r/min搖床中反應(yīng)2 h后取樣，利用高效液相色譜檢測(cè)苯基乳酸含量。

1.4.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

分別考察不同誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的影響。重組大腸桿菌基礎(chǔ)誘導(dǎo)條件如下：培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)2 h。

1.4.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

在優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)條件下，進(jìn)一步探索并優(yōu)化全細(xì)胞的轉(zhuǎn)化條件。分別考察葡萄糖濃度、溫度、菌體量、底物濃度、金屬離子、表面活性劑、是否進(jìn)行超聲破碎和有機(jī)溶劑處理等因素，對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的影響。重組大腸桿菌基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化條件如下：收集15 g/L菌體(干重)重懸于含9 g/L PPA的轉(zhuǎn)化液中，置于37 200 r/min搖床中，轉(zhuǎn)化2 h。

1.4.4 補(bǔ)料分批添加對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

在最佳誘導(dǎo)條件下，培養(yǎng)后離心得菌體，取30 g/L菌體重懸于轉(zhuǎn)化液中。轉(zhuǎn)化液中初始底物PPA質(zhì)量濃度為5 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L。分別以不同方式分批補(bǔ)加葡萄糖和PPA。

1.5 分析方法

苯丙酮酸鈉和D-苯基乳酸的檢測(cè)：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱；1 mmol/L H2SO4-乙腈(V(H2SO4)∶V(乙腈)=85∶15)，流速0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL[15]。

葡萄糖濃度的測(cè)定采用SBA-40D傳感分析儀檢測(cè)。

菌體干重(DCW)：將培養(yǎng)物抽濾，60 ℃烘干至恒重，稱(chēng)重。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的影響進(jìn)行了考察，由圖2-A可知，當(dāng)IPTG終濃度小于0.2 mmol/L時(shí)，苯基乳酸的產(chǎn)量隨IPTG濃度的增加而增加，當(dāng)IPTG終濃度達(dá)0.2 mmol/L時(shí)，苯基乳酸的產(chǎn)量最高達(dá)到3.56 g/L，但隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加，苯基乳酸產(chǎn)量下降。圖2-B可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，苯基乳酸產(chǎn)量逐漸上升，苯基乳酸產(chǎn)量在誘導(dǎo)4 h時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于4 h后，苯基乳酸的產(chǎn)量開(kāi)始下降。原因可能是隨著誘導(dǎo)劑量的增加、誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組大腸桿菌地生長(zhǎng)受到了抑制。

圖2 不同誘導(dǎo)條件對(duì)苯基乳酸轉(zhuǎn)化合成的影響

Fig.2 Effects of different induction conditions on the conversion and synthesis of phenyllactic acid

最終選取誘導(dǎo)劑ITPG的最佳終濃度為0.2 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

2.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1 轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)還分別考察轉(zhuǎn)化體系中葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)化溫度、菌體量、底物PPA濃度、金屬離子及表面活性劑等因素對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3-A可知，與未添加葡萄糖相比，添加葡萄糖后的苯基乳酸產(chǎn)量提高了12倍，原因是菌體對(duì)葡萄糖的代謝，可以為轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供大量的能量和NADH，使反應(yīng)可以持續(xù)進(jìn)行。但隨著葡萄糖濃度的升高，超過(guò)5 g/L時(shí)，苯基乳酸產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)化結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)化液pH值都有不同程度的下降，推測(cè)可能是葡萄糖在代謝中產(chǎn)生了酸性副產(chǎn)物，如乙酸、乳酸等，從而抑制了菌體的活性。因此最終選取的最佳葡萄糖濃度為5 g/L。

由圖3-B可知，當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度由32 ℃升高至37 ℃時(shí)，苯基乳酸的產(chǎn)量也隨之提高；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度從37 ℃提高至42 ℃，產(chǎn)量無(wú)明顯變化。乳酸脫氫酶的最適溫度為37 ℃，采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法的優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)酶具有一定的保護(hù)作用，溫度的變化使酶不容易失活，故最終選取37 ℃作為最佳轉(zhuǎn)化溫度。

由圖3-C可知，菌體量對(duì)苯基乳酸產(chǎn)量也有一定影響，與初始菌體量(15 g/L)相比，當(dāng)使用30 g/L菌體量進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，產(chǎn)量有所提升，原因可能是由于菌體的增多從而增加了乳酸脫氫酶的總量，提高了苯基乳酸產(chǎn)量；而當(dāng)菌體量大于30 g/L時(shí)，產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，可能是由于菌體繼續(xù)增加，菌體與底物間接觸面積減小，同時(shí)增加了葡萄糖的消耗，減少了反應(yīng)時(shí)間，使得苯基乳酸的產(chǎn)量下降。故本實(shí)驗(yàn)選取30 g/L菌體量作為最佳菌體量。

由圖3-D可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度小于13 g/L時(shí)，苯基乳酸的產(chǎn)量隨著底物質(zhì)量濃度的增加不斷提高，但在底物質(zhì)量濃度9～13 g/L之間，變化不明顯；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)13 g/L時(shí)，產(chǎn)量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是隨著底物質(zhì)量濃度的不斷提高，酶的活性部位被抑制，使產(chǎn)量也隨之下降。最終選取最佳底物質(zhì)量濃度為13 g/L。

由圖3-E可知，相比較不加金屬離子的對(duì)照組，添加金屬離子Na+、Mg2+、K+對(duì)產(chǎn)量有一定的提升，原因是金屬離子可以作為酶的激活劑從而提高酶的轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)采用了同1種金屬離子1 mmol/L和100 mmol/L 2種濃度進(jìn)行比較，從圖中可知，與1 mmol/L金屬離子濃度相比，100 mmol/L金屬離子對(duì)產(chǎn)量提升效果更加明顯。縱向比較3種離子的效果，可以得出Mg2+效果最佳。

由圖3-F可知，各類(lèi)表面活性劑的添加對(duì)產(chǎn)量均有一定的提升作用，但需要控制好添加濃度，否則會(huì)使菌體破裂，使酶活下降，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度降低，如0.1%的Triton X-100會(huì)使產(chǎn)量大幅度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知PEG-200、PEG-400和吐溫-80都可添加至轉(zhuǎn)化液中提高產(chǎn)量。

最終選取最佳轉(zhuǎn)化條件：5 g/L葡萄糖，13 g/L PPA，轉(zhuǎn)化溫度為37 ℃，30 g/L菌體量。單批次苯基乳酸最大產(chǎn)量可達(dá)5.2 g/L，產(chǎn)率為40%。

圖3 不同全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系對(duì)苯基乳酸合成的影響

Fig.3 Effects of different whole cell transformation systems on the synthesis of phenyllactic acid

2.2.2 菌體處理對(duì)合成苯基乳酸的影響

本實(shí)驗(yàn)采用超聲功率為120 w，超聲3 s、停3 s的破碎方法，對(duì)菌體進(jìn)行超聲處理，結(jié)果見(jiàn)圖4，隨著超聲破碎的時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)量大幅下降，可能是因?yàn)槌曋率咕w的破裂，胞內(nèi)NADH無(wú)法再生，并且在超聲過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，酶易變性失活，使得反應(yīng)終止，產(chǎn)量下降。由圖4-B可知，菌體經(jīng)10%濃度乙醇浸泡后，產(chǎn)量比原來(lái)提高了約15%。菌體經(jīng)1%丙酮浸泡后，產(chǎn)量提升了22.6%，而經(jīng)10%丙酮浸泡后，產(chǎn)量下降29.2%，低濃度乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑可以提高細(xì)胞膜的通透性，增加了底物在胞內(nèi)的濃度，提高了酶與底物的接觸幾率。但高濃度的有機(jī)溶劑易使大腸桿菌細(xì)胞溶解，造成NADH無(wú)法再生，并可能使酶變性失活，造成反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行，苯基乳酸的產(chǎn)量降低。初步判斷大腸桿菌菌體經(jīng)1%丙酮浸泡處理后，具有較好提高苯基乳酸產(chǎn)量的作用。

圖4 不同菌體處理方式對(duì)苯基乳酸合成的影響

Fig.4 Effects of different bacteria treatments on the synthesis of phenyllactic acid

2.2.3 補(bǔ)料分批添加對(duì)產(chǎn)量的影響

對(duì)底物和葡萄糖分批添加底物的初步探索，底物PPA按圖5中所示3種方式添加，對(duì)比3種底物添加方式，圖5-A中方式最好，通過(guò)表1數(shù)據(jù)可知，補(bǔ)料添加后產(chǎn)率提高至52.7%，產(chǎn)量為7.38 g/L. 分批添加底物與葡萄糖，可不斷提供能量和還原型輔酶NADH，有效解除高濃度底物的抑制，提高產(chǎn)量和產(chǎn)率。

A-每隔20 min，固定補(bǔ)加3 g/L PPA，共補(bǔ)加3次；B-每隔20 min，PPA補(bǔ)加至5 g/L，共補(bǔ)加3次；C-每隔30 min，PPA補(bǔ)加至5 g/L，共補(bǔ)加2次

圖5 底物(PPA)與葡萄糖分批添加方式對(duì)苯基乳酸合成的影響

Fig.5 Effects of substrate and glucose batch addition on the synthesis of phenyllactic acid

表1 苯基乳酸產(chǎn)量對(duì)比

Table 1 Comparison of phenyllactic acid Production

文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)率[11]優(yōu)化前優(yōu)化后單批發(fā)酵補(bǔ)料發(fā)酵PLA產(chǎn)量/(g·L-1)0.70.255.27.38生產(chǎn)率/%/2.7840.052.7

3 結(jié)論

通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，本文探索并優(yōu)化了重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的條件，最終確定了最佳誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化條件。同時(shí)以苯丙酮酸鈉作為底物，在最佳條件下，苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到7.38 g/L，產(chǎn)率為52.7%，與優(yōu)化前相比，產(chǎn)量提高了近30倍。通過(guò)添加不同金屬離子、表面活性劑及菌體有機(jī)溶劑處理的研究，發(fā)現(xiàn)這些因素對(duì)產(chǎn)量都有不同程度的提高。并且底物分批添加的方式能有效解除高濃度底物的抑制，從而有效提高苯基乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率，為進(jìn)一步提高苯基乳酸的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率奠定了基礎(chǔ)。

在苯丙酮酸鈉轉(zhuǎn)化為苯基乳酸的酶促反應(yīng)中，伴隨著NADH的消耗，有文獻(xiàn)報(bào)道輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建，即通過(guò)將2個(gè)酶反應(yīng)偶聯(lián)使得NADH再生，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)NAD+/NADH的循環(huán)，對(duì)產(chǎn)率提高具有明顯作用[15]?？梢钥闯鲋亟M大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的產(chǎn)率仍有較大提升空間，具有廣闊的前景。