大腸桿菌產(chǎn)脂肪酶代謝通量分析

左正三,張柯,宋萍*,黃寶琪, 方心草, 黃和

1(南京北盛榮能源科技有限公司,江蘇 南京，211178) 2(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京，211816) 3(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京，211816)

脂肪酶(Lipase， EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一類特殊的酯鍵水解酶，作為生物催化劑具有底物專一性好，立體選擇性強和反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品易分離等優(yōu)點[1]。因此，利用脂肪酶作為催化劑進行高選擇性和高效地有機合成是當今合成化學(xué)的熱點，更因為其對環(huán)境友好和節(jié)約能源等特點，被人們稱為“綠色化學(xué)”而備受矚目?？莶輻U菌(Bacillussubtilis)脂肪酶LipA為分泌性蛋白，具有高度專一的立體選擇性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分子量最小的脂肪酶之一，這些特點使枯草桿菌脂肪酶近年來受到關(guān)注。然而，在酶蛋白的合成表達過程中，細胞能量供應(yīng)不足或產(chǎn)生較多有毒中間代謝產(chǎn)物，都會影響酶的持續(xù)高效合成[2]。因此本研究從整個代謝網(wǎng)絡(luò)入手，從代謝層次深入認知各種代謝物與目標產(chǎn)物間的關(guān)系。

代謝通量分析(metabolic flux analysis，MFA)又稱代謝流分析[3]，是一種計算流經(jīng)各種代謝途徑的物質(zhì)流的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞代謝分支點的物質(zhì)流分布，在代謝工程中占有重要地位。通過計算不同途徑或不同條件下的代謝通量分布，可以表征細胞的代謝能力[4]，發(fā)現(xiàn)遺傳修飾對細胞代謝狀態(tài)的影響，從而為進一步更加合理地遺傳改造提供理論依據(jù)。近年來，MFA在燃料乙醇、1，3-丙二醇、有機酸(乳酸、丁二酸等)、維生素、氨基酸(谷氨酸、賴氨酸等)和抗生素等重要發(fā)酵產(chǎn)品，新藥開發(fā)以及環(huán)境生物技術(shù)方面都取得重要進展。但是將MFA應(yīng)用于蛋白合成過程的僅有少數(shù)研究。CALIK[5]在1999年發(fā)表了第1篇關(guān)于蛋白合成代謝通量分析的研究，考察了B.licheniformis的EMP途徑、PP途徑、TCA循環(huán)和氨基酸合成途徑等，建立了B.licheniformis的中間代謝途徑模型。SONG[6]等基于代謝流分析開發(fā)了雙階段供養(yǎng)策略，提高了B.subtilis脂肪酶產(chǎn)量。

本文通過建立代謝流量平衡模型[7]，分析了誘導(dǎo)前后重組大腸桿菌合成脂肪酶過程中代謝通量分布，確定影響酶合成的關(guān)鍵節(jié)點、關(guān)鍵途徑，為脂肪酶高表達和高比活發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶LipA重組菌的構(gòu)建

根據(jù)B.subtilis168染色體上lipA基因核酸序列，設(shè)計PCR引物lip A-up (5′-CCGGAATTCATGGCAAAGAAAGACGAACAC-3′)和lip A-down (5′- CCCAAGCTTTGCTTGTGCTTGACG-3′)，在lipA-up和lip A-down中分別引入SalⅡ和HindⅢ酶切位點。以B.subtilis168基因組為模板，PCR擴增約1 kb的lipA基因片段。PCR產(chǎn)物與表達載體pET22b，分別用EcoRI和HindⅢ雙酶切后進行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10，在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上隨機挑取單菌落進行驗證，篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)提取質(zhì)粒、酶切電泳以及PCR檢測，證明得到了含有l(wèi)ipA的重組質(zhì)粒pET22b-lipA。重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliBL21，獲得重組菌BL21- pET22b-lipA。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

種子活化：接種1環(huán)斜面活化菌株接入裝有50 mL LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基g/L:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10)的三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。

一級種子培養(yǎng)：將種子以5%的接種量接入250 mL裝有50 mL M9培養(yǎng)基(M9培養(yǎng)基g/L： Na2HPO4·7H2O 17.096， KH2PO43， NaCl 0.5， NH4Cl 1， MgSO40.493， CaCl20.011 1， 葡萄糖4， 自然pH)的三角瓶中， 37 ℃、200 r/min發(fā)酵6 h。

二級種子培養(yǎng)：將一級種子以5%的接種量接入250 mL裝有50 mL M9培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min發(fā)酵10 h。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：5 L發(fā)酵罐裝液量為3 L，將5%二級種子培養(yǎng)液接入含有M9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，用2 mol/L NaOH控制發(fā)酵過程pH為7.0，于37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1.0 vvm條件下培養(yǎng)；待發(fā)酵液OD600達到0.6～0.8時，加終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶，在30 ℃條件下產(chǎn)酶。

1.3 分析方法

葡萄糖的測定[8]：通過SBA-40C生物傳感儀測定。

生物量的測定[9]：采用紫外分光光度計測定OD600下吸光值，去離子水做空白，并記錄數(shù)據(jù)。

脂肪酶活力測定方法[10]：以對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-nitrophenylpalmitate,pNPP)為底物的分光光度法測定脂肪酶酶活。

有機酸濃度的測定[6]：采用高效液相色譜法，色譜柱：Sepax C18(250 mm×4.6 mm， 5μm)；流動相：C:10 mmol/L磷酸(pH=2.14)；D：乙腈。檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

氨基酸濃度的測定[6]：發(fā)酵液上清通過衍生化，采用高效液相色譜法，色譜柱：Sepax AA專用柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：0.1 mol/L，pH 6.5醋酸鈉溶液(含7% 乙腈)；B：乙腈(含25% 水)。流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：36 ℃。

菌體干重的測定[11]：取5mL發(fā)酵液，離心8 000 r/min，5 min收集菌體，用蒸餾水洗滌2～3次，離心后菌體60 ℃烘干至恒重，稱重。

蛋白含量的測定[12]：采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，標準蛋白為牛血清蛋白(BSA)。

1.4 代謝通量分析方法

根據(jù)E.coli的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和KEGG等數(shù)據(jù)庫資源[13]，結(jié)合E.coli的生長代謝特性，建立了E.coli代謝合成脂肪酶的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)(圖1)及其代謝通量平衡模型，包括主要的碳骨架代謝途徑和氨基酸生物合成途徑。在建立網(wǎng)絡(luò)模型時做了以下假設(shè)和簡化處理：1)細胞中的中間代謝物處于擬穩(wěn)態(tài)，即瞬間濃度變化為0；2)只考慮主要中心碳代謝反應(yīng)的物流平衡[14]；3)無分支點的幾個連續(xù)反應(yīng)簡化為一個反應(yīng)式，所有反應(yīng)包括生物量合成都按照固定比例進行；4)能量供需平衡，即合成菌體與產(chǎn)物所需的能量和EMP、HMP及TCA循環(huán)產(chǎn)生的能量總數(shù)相等。E.coli中NADH和FADH2都可以通過電子傳遞鏈生成ATP[15]；5)葡萄糖進入細胞均需消耗ATP；6)脂肪酶LipA的反應(yīng)方程是根據(jù)其氨基酸組成確定的[16]，蛋白質(zhì)合成所需要的能量為4.306 μmol ATP/μmol氨基酸[17]，LipA的蛋白濃度通過SDS-PAGE電泳分析得到；7)在代謝過程中，由于一部分碳源用于細胞的維持、產(chǎn)能、CO2釋放以及分泌其它一些未知的代謝產(chǎn)物等，造成碳源的不平衡現(xiàn)象，該部分通量在代謝網(wǎng)絡(luò)通量的計算時，并入生物量通量(VBiomass)中，生物量反應(yīng)方程根據(jù)文獻[18]建立。模型中包含的反應(yīng)如表1，涉及到的簡稱如表2所示。

代謝通量分析根據(jù)代謝路徑中各反應(yīng)的計量關(guān)系以及底物、產(chǎn)物的通量和細胞組成等確定代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布。對于胞內(nèi)代謝物采用擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)：假設(shè)細胞內(nèi)的中間代謝物均處于擬穩(wěn)態(tài)[19]，即其整個濃度變化速率為0；對于胞外代謝產(chǎn)物則通過檢測發(fā)酵液中該產(chǎn)物的比生產(chǎn)速度得到。于是可以得到Av=rmet，其中A(49×50)為化學(xué)計量系數(shù)矩陣，v(49×1)為代謝通量向量，rmet為代謝物凈積累速率向量(50×1)[20]。整個代謝網(wǎng)絡(luò)包含49個代謝反應(yīng)，其中中間代謝物為45個，則自由度為4。該代謝網(wǎng)絡(luò)中可測速率有5個，即葡萄糖消耗速率以及乳酸、乙酸、lipA和生物量的生成速率?？紤]到氨基酸是脂肪酶組成的重要組分可能存在胞外分泌，因此也檢測了胞外20種基本氨基酸濃度變化。由于可測定的速率大于自由度，則該體系為超定系統(tǒng)，可用最小二乘法求得簡單解，利用MATLAB 7.1軟件求得代謝分布。在此代謝網(wǎng)絡(luò)中以100 mmol/(g·DCW·h)的葡萄糖的碳摩爾量為計算基準，所有代謝通量v的單位均為mmol/(g·DCW·h)[21]。

表1 代謝模型中包含的反應(yīng)

表2 代謝模型中的簡稱

圖1 重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪酶LipA代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

Fig.1 Metabolic reaction network for LipA production in Recombinant E. coli

2 結(jié)果與討論

2.1 5 L罐中重組大腸桿菌產(chǎn)LipA的發(fā)酵性能研究

在發(fā)酵過程中(圖2)，菌體沒有明顯延遲期，在0～4 h葡萄糖的消耗速率一直維持在0.46 g/(L·h)。3 h時，OD600達到0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG進行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，此時葡萄糖的消耗速率開始降低，可能是由于IPTG的毒性造成的。加入誘導(dǎo)劑后，E.coli開始大量產(chǎn)酶，5 h時比活達到最高值18.11 U/mg。隨著發(fā)酵的進行，脂肪酶比活開始降低，8 h時比活降至14.14 U/mg。

圖2 E.coli在5 L罐中發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

Fig.2 Enzyme production curve of E.coli fermentation in 5 L fermenter

采用SDS-PAGE對菌體胞內(nèi)蛋白進行分析，結(jié)果如圖3所示。LipA脂肪酶的分子質(zhì)量為19.1 kDa。1～3 h時，在14.3～20.1 kDa之間無特征條帶出現(xiàn)，說明未誘導(dǎo)時宿主菌E.coliBL21不產(chǎn)LipA。發(fā)酵3 h加入誘導(dǎo)劑后，LipA開始表達。隨著誘導(dǎo)時間的延長，LipA的表達量在7 h時達到最大(LipA占總蛋白含量為3%)，然而到了9 h時各組分蛋白條帶不清晰且LipA無條帶?？赡苁且驗樵趯?shù)后期和平穩(wěn)期時細胞內(nèi)蛋白酶的積累，分解了總蛋白，因此導(dǎo)致了包含脂肪酶在內(nèi)的蛋白含量的下降[24]。

M-protein marker；1～9-E. coli BL21 pET2 2b-lipA 1～9 h發(fā)酵粗酶液

圖3 重組大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)脂肪酶的SDS-PAGE分析圖

Fig.3 SDS-PAGE analysis of LipA production induced by recombinant E. coli

2.2 誘導(dǎo)對有機酸及氨基酸的影響

發(fā)酵液中有機酸和氨基酸等雜酸含量是微生物發(fā)酵過程的另一個重要指標，通過對其分析，能夠從另一個角度更加全面的了解微生物的發(fā)酵過程?？梢詸z測到的副產(chǎn)物如圖4，圖5所示。通過與20種基本氨基酸標品色譜圖對照，顯示發(fā)酵液能檢測到精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)共4種氨基酸。氨基酸濃度的變化隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)上下波動的趨勢。其中，濃度最高的是纈氨酸，最高濃度達到22 mmol/L。其他氨基酸的濃度都基本在5 mmol/L以下。分析為氨基酸在發(fā)酵過程中不斷生成又不斷消耗造成的，并且在發(fā)酵中后期，可能由于營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，纈氨酸被用作為氮源促進菌體生長[26]，所以在6 h時纈氨酸濃度會降低。同時發(fā)酵中后期，由于呼吸作用細胞內(nèi)的ROS會積累，過量的ROS會對菌體造成損傷[28]。亮氨酸和脯氨酸具有抵御胞內(nèi)ROS的作用，菌體分泌亮氨酸和脯氨酸防止ROS對菌體造成損傷[27]，可能因此造成了亮氨酸和脯氨酸濃度增加。此外，本研究還測定了發(fā)酵液中的12種有機酸，然而在培養(yǎng)基中只檢測到了乳酸(Lac)。乳酸在發(fā)酵前期濃度較低，3 h時濃度為0.33 mmol/L，在4 h時達到最大濃度5.10 mmol/L，5 h時濃度開始降低至0.27 mmol/L，在發(fā)酵末期9 h時乳酸濃度又回升至2.26 mmol/L。圖2可以看出，在4 h時，菌體生物量已經(jīng)達到較高水平且增長變緩，溶氧下降，因此導(dǎo)致乳酸濃度升高。但是隨著發(fā)酵的進行，碳源也被迅速消耗，導(dǎo)致生成的乳酸被用作成碳源維持細胞生長[25]，所以乳酸濃度出現(xiàn)了降低。而發(fā)酵末期，發(fā)酵液溶氧效果差，細胞進行無氧呼吸，又導(dǎo)致了乳酸的增加。至于是否IPTG誘導(dǎo)導(dǎo)致乳酸在誘導(dǎo)前后出現(xiàn)較大變化還有待進一步研究。

圖4 LipA發(fā)酵過程中有機酸濃度曲線

Fig.4 Concentration curve of organic acid produced byE.coli f in LipA fermentation

圖5 LipA發(fā)酵過程中氨基酸濃度曲線

Fig.5 Concentration curve of amino acid produced byE.coli in LipA fermentation

2.3 誘導(dǎo)對代謝流遷移的影響

對誘導(dǎo)前1 h(發(fā)酵時間2 h)和誘導(dǎo)后1 h(發(fā)酵時間4 h)的數(shù)據(jù)進行代謝通量分析。在3 h時，重組大腸桿菌開始誘導(dǎo)產(chǎn)酶，此時細胞內(nèi)的代謝流量分布開始發(fā)生顯著變化，因此對誘導(dǎo)前后時間點進行代謝流分析，如圖6所示。

圖6 誘導(dǎo)前后的代謝通量分布圖

Fig.6 Distribution of metabolic flux before and after induction

注：反應(yīng)方程編號:發(fā)酵2 h代謝通量/發(fā)酵4 h代謝通量

乳酸合成途徑(r19)的代謝通量在誘導(dǎo)前后變化最為明顯。經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，r19代謝通量由0顯著增加至137.09，碳流通過EMP途徑生成乳酸，分流了部分合成生物量的碳流，降低了生物量合成的速率，造成這種現(xiàn)象的原因是指數(shù)生長后期，菌體大量生長，發(fā)酵體系中的溶氧不能滿足菌體生長的要求，部分菌體進行無氧呼吸，導(dǎo)致乳酸途徑的通量增加。這與圖2中OD600的變化速率相符。本研究也與SONG等的研究相符，SONG等指出在指數(shù)生長期提供較高的溶氧，有利于脂肪酶的合成[6]。在組成脂肪酶的181個氨基酸中，亮氨酸占比10.4%，纈氨酸占4.9%，脯氨酸占比2.2%，精氨酸占比3.3%，亮氨酸和纈氨酸占比相對較高，且從圖6代謝通量圖中可以看出，纈氨酸代謝通量(r36)由0增加至60.68，而脯氨酸(r41)、精氨酸(r39)、亮氨酸(r35)代謝通量無變化。纈氨酸的通量的增加可能是由于該時刻脂肪酶大量合成，對纈氨酸的需求增加所致。同時代謝通量分析的數(shù)據(jù)也解釋了6 h時纈氨酸濃度出現(xiàn)下降的原因，消耗的纈氨酸可能被用于脂肪酶合成。但是代謝通量的數(shù)據(jù)并不能解釋胞內(nèi)亮氨酸和脯氨酸在發(fā)酵6 h后出現(xiàn)增加。推測可能在發(fā)酵中后期，由于有氧呼吸作用造成細胞內(nèi)的ROS的積累，過量的ROS會對菌體造成損傷[28]。亮氨酸和脯氨酸具有抵御胞內(nèi)ROS的作用，菌體分泌亮氨酸和脯氨酸防止ROS對菌體造成損傷[27]，因此可能會造成了亮氨酸和脯氨酸濃度增加。

誘導(dǎo)后，磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)和ATP合成的通量出現(xiàn)了下降。磷酸戊糖途徑中的R5P(r7)通量下降了43.4%，造成誘導(dǎo)生物量積累速度減緩。作為能量供應(yīng)環(huán)節(jié)的TCA循環(huán)通量(r11-r15)和ATP合成通量(r43-r46)降低明顯。酶蛋白的表達和折疊需要ATP作為能供應(yīng)[22-23]，誘導(dǎo)后ATP供應(yīng)不足，可能是E.coli中不能高效表達脂肪酶的一個原因。

3 結(jié)論

通過對E.coli產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵特性研究，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)2 h后(發(fā)酵時間5h)胞內(nèi)脂肪酶比活達到最高18.11 U/mg。通過建立重組E.coli產(chǎn)脂肪酶LipA的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，分析誘導(dǎo)前后的代謝流遷移發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，乳酸代謝通量增加，碳流通過EMP途徑生成乳酸，分流了部分合成生物量的碳流，降低了生物量合成的速率；纈氨酸通量的增加滿足了脂肪酶的合成需求；ATP通量的減少限制了脂肪酶的高效合成。因此乳酸和ATP是E.coli合成脂肪酶合成的關(guān)鍵節(jié)點。本研究為提高生產(chǎn)脂肪酶菌種的發(fā)酵條件優(yōu)化和代謝途徑改造提供了理論依據(jù)。