廣金錢草總黃酮的提取方法及藥理作用研究進(jìn)展※

張子婷 鐘輕嬌 周碧瑤 朱湞臻 張 蕓 韋燕飛 陳永欣

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 530001）

廣金錢草（Herba DesmodiiStyracifolii）又名金錢草、銅錢草、落地金錢、假花生，為豆科植物廣金錢草（Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.）的干燥地上部分，主要分布在廣東、廣西、福建、湖南等省區(qū)。始載于《嶺南采藥錄》一書，曰：“本品系蝶形花科山綠豆屬中的一種直立亞灌木”，并附文獻(xiàn)考證，“現(xiàn)代繆永祺謂金錢草治療膀胱結(jié)石甚為有奇效”［1］。其有清熱利濕、利尿通淋的效用，用于腎炎水腫、尿路結(jié)石、尿路感染、膽囊結(jié)石、黃疸肝炎等癥的醫(yī)治。廣金錢草主要含有黃酮、生物堿、酚類、鞣質(zhì)、多糖等成分。此外，還含有揮發(fā)性成分、皂苷、有機(jī)酸等。其質(zhì)量分析主要以黃酮成分為對照品進(jìn)行定量分析研究［2］。蘇亞倫等［3］從廣金錢草中分到4個(gè)黃酮碳甙化合物。通過光譜解析，鑒定它們的結(jié)構(gòu)為異牡荊苷、6-C-木糖-8-C-葡萄糖洋芹素、6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素和異葒草苷。王植柔等［4］從廣金錢草的甲醇提取物中分離出夏佛塔苷、異葒草苷、異牡荊苷3種黃酮類化合物。國內(nèi)外學(xué)者對廣金錢草所含的黃酮類成分也有較具體的報(bào)道。本文著重于近年來廣金錢草總黃酮在提取方法、藥理作用等方面的研究進(jìn)展。

1 廣金錢草總黃酮的提取方法

1.1 水提法 向松濤等［5］將廣金錢草放入適量水中浸泡，煮沸后再過濾，藥渣加水再煮，合并濾液，濃縮為浸膏，待用。張慧［6］按料液比 1∶8加入水，100℃ 水浴之中浸提1 h，然后四層紗布過濾，合并濾液，提取液定容在25 mL容量瓶加 8倍量水回流提取 3次，每次1.5 h，其結(jié)果所得提取液的平均總黃酮含量為0.950 3%；汪茜等［7］取廣金錢草藥粉碎，過 40目篩后，于 80℃ 水浴中，用20倍量50%乙醇回流提取 2次其每次 1.5 h，提取液體經(jīng)濾紙過濾，將其稀釋至質(zhì)量濃度相當(dāng)于含總黃酮 8.0 mg/mL，調(diào)節(jié) pH值至 4.0～6.0，最終得廣金錢草浸膏待用。

1.2 醇提法 王植柔等［4］用甲醇與廣金錢草回流煮沸后過濾，減壓濃縮，得甲醇提取物待用。郭盼盼等［8］將廣金錢草藥材進(jìn)行粉碎，用50%乙醇回流提取2次，合并提取液。提取液經(jīng)抽濾后，減壓濃縮（50℃），濃縮液經(jīng)冷凍干燥得總黃酮粗提物。

1.3 酶解法 羅蘭等［9］采用酶解法提取，在干燥的廣金錢草粗粉加10倍量水混勻，加入纖維素酶酶解。而后用80%的乙醇溶液提取，冷卻過濾，再向藥渣中加 60%乙醇回流，冷卻過濾，棄去藥渣。合并提取液，濃縮，用50%甲醇溶解并且定容即可得。

1.4 半仿生法 此法模擬口服藥經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的環(huán)境，選用活性指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離獲得提取物［10］。羅蘭等［9］采用干燥的廣金錢草粗粉，選擇pH為2.2的磷酸氫二鈉緩沖液作為浸取劑，模擬胃腸道pH。在40℃下回流提取3次，合并提取液，濃縮，再用50%甲醇溶解并定容即得。張慧等［11］研究復(fù)方金錢草中廣金錢草、路路通、車前子3種君藥的半仿生提取工藝最佳條件。其實(shí)驗(yàn)測定了復(fù)方金錢草中各君藥半仿生提取液中總黃酮的含量，并利用響應(yīng)面分析法得出了最佳條件。

1.5 超聲波輔助提取廣金錢草總黃酮法 此法提取酮類是采用超聲波空化作用使溶劑充分、快速進(jìn)入提取物內(nèi)部，可不影響提取物結(jié)構(gòu)和活性且能升高提取率、節(jié)約溶劑［12］。林瑤等［13］采用廣金錢草細(xì)粉加 60% 乙醇超聲提取，過濾，濾渣再加入60%乙醇超聲提取，過濾。重復(fù)3次，合并3次濾液，減壓回收乙醇，80℃水浴濃縮至膏狀，用60%乙醇溶解即得。王曉林等［14］以廣金錢草提取干浸膏中總黃酮的含量為指標(biāo)，分別考察料液比、乙醇的濃度、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)等對提取效果的影響。采用單因素和正交試驗(yàn)確定超聲波輔助提取的工藝條件，優(yōu)化了提取工藝條件。

1.6 超聲波輔助半仿生法提取廣金錢草總黃酮 郭楚楚等［15］采用超聲波協(xié)同半仿生法，在單因素的基礎(chǔ)上，據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法?？疾炝弦罕?、超聲功率和提取時(shí)間對總黃酮得率的影響，并優(yōu)選出最佳工藝。

1.7 響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝 此法將試驗(yàn)中的目標(biāo)響應(yīng)值作為單個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)因素的函數(shù)，用多維圖形顯示函數(shù)，用圖形分析等優(yōu)化最佳條件［16］?；诖颂崛】傸S酮的方程模型適用性強(qiáng)，優(yōu)化工藝條件準(zhǔn)確可靠。程軒軒等［17］用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取工藝，在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法?？疾烀附鈺r(shí)間、溫度、酶用量和pH值對總黃酮得率的影響，得到提取的最佳參數(shù)。陳新等［18］采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超濾工藝，選擇跨膜壓力、藥液溫度及藥液濃度為自變量，總黃酮純度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)研究各自變量及其交互作用對總黃酮提取率的影響，得到了超濾的優(yōu)化工藝。

1.8 正交法優(yōu)選提取工藝 此法根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有均勻分散，齊整可比特征的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，從而得到最優(yōu)因子的組合［19］。王鑫等［20］采用正交試驗(yàn)，以總黃酮提取量為指標(biāo)，醇濃度、加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為因素進(jìn)行試驗(yàn)，得出最佳提取工藝條件。王曉林，鐘方麗等［21］采用正交實(shí)驗(yàn)法，以原藥材的總黃酮提取量為評價(jià)指標(biāo)。選擇提取用水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、醇沉濃度為考察因素，采用正交實(shí)驗(yàn)法確定廣金錢草中總黃酮的最佳工藝。

1.9 大孔樹脂純化工藝 此法依靠范德華引力通過多孔結(jié)構(gòu)對分子大小不同的物質(zhì)進(jìn)行篩選，使有機(jī)化合物可經(jīng)一定溶劑洗脫分開，而達(dá)到分離、純化、除雜等目標(biāo)［22］。張鏢等［23］采用靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附-解吸附方法進(jìn)行純化，以吸附率與洗脫率等指標(biāo)優(yōu)化工藝，得到最佳工藝。張蕾等［24］采用紫外-可見分光光度法純化，以總黃酮吸附率、解吸率為評價(jià)指標(biāo)。通過考察樹脂類型、原料液質(zhì)量濃度、pH值、上樣體積流量、解吸溶劑、水除雜用量、最佳上樣量、醇洗脫體積流量等，綜合評判得到最優(yōu)工藝。

2 廣金錢草總黃酮藥理作用

2.1 抗氧化作用 郭盼盼等［8］以抗壞血酸（VC） 為陽性對照，通過廣金錢草總黃酮提取物（PTFE）對DPPH自由基清除能力試驗(yàn)及對鐵氰化鉀的還原能力試驗(yàn)，評估PTFE的抗氧化活性。結(jié)果表明PTFE具有良好的抗氧化活性且與抗氧化作用呈量效關(guān)系。林瑤等［13］用采用鄰苯三酚自氧化法發(fā)現(xiàn)廣金錢草總黃酮提取物具有清除DPPH自由基、超氧自由基和羥基自由基和還原Fe3+并產(chǎn)生Fe2+的能力。研究表明，廣金錢總草黃酮具有一定的抗氧化活性，且兩者呈正相關(guān)，為研究抗氧化劑提供參考。余麗麗等［25］通過紫外分光光度法測定總黃酮濃度、利用普魯士蘭法評估廣金錢草總黃酮還原Fe3+的能力，發(fā)現(xiàn)廣金錢草對Fe3+具有較強(qiáng)的還原能力，為論證該物質(zhì)具有抗氧化能力增強(qiáng)說服力。

2.2 防治結(jié)石 Tomoko等［26］發(fā)現(xiàn)，廣金錢草中的一個(gè)黃酮化合物schaftoside可預(yù)防腎結(jié)石，他們已就該化合物的葡萄糖苷或阿拉伯糖苷的注射劑或口服劑型在日本獲專利授權(quán)。汪茜等［21］將實(shí)驗(yàn)分為空白組、治療對照組、成石組和治療組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析得出廣金錢草總黃酮有降低24 h尿草酸濃度，增加尿鈣、尿鎂及尿枸櫞酸濃度的能力，從而抑制大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成。盧兗偉等［27］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣金錢草總黃酮可明顯降低成石大鼠血清中尿酸和肌酐的含量，從而能有效抑制乙二醇中毒致Wistar雄性大鼠腎草酸鈣結(jié)石的形成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)將人膀胱草酸鈣混合型結(jié)石植入大鼠膀胱內(nèi)，連續(xù)4周每天單次灌胃廣金錢草總黃酮可使結(jié)石減小。李文淑等［28］研發(fā)的廣金錢草總黃酮膠囊對構(gòu)建的大鼠尿路結(jié)石模型具備一定的治療和預(yù)防效果。Wang X等［29］發(fā)現(xiàn)，廣金錢草總黃酮對大鼠乙二醇性草酸鈣腎結(jié)石有治療作用，對乙二醇中毒性草酸鈣腎結(jié)石有預(yù)防作用，對植入大鼠膀胱內(nèi)人的膀胱結(jié)石有溶石作用。有研究發(fā)現(xiàn)，廣金錢草總黃酮可以通過抗氧化、抗炎、堿化尿等機(jī)制而發(fā)揮抗損傷等作用，進(jìn)而減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，達(dá)到減少結(jié)石在腎臟的沉積的效果［30］。

2.3 利尿作用 盧兗偉等［27］進(jìn)行了廣金錢草總黃酮對麻醉狗輸尿管動(dòng)作電位影響的實(shí)驗(yàn)，通過自身前后對照比較輸尿管動(dòng)作電位的頻率及幅度的改變，發(fā)現(xiàn)使用后可引起輸尿管動(dòng)作電位頻率明顯增加，電位幅度降低，尿量排出增加。

2.4 保護(hù)心腦血管 許實(shí)波等［31］通過藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)廣金錢草總黃酮能夠顯著增加在體狗心腦血流量，降低心腦血管阻力，略降低血壓、減緩心率，對小鼠常壓缺氧具有耐受力，對急性缺血性心肌缺血具有保護(hù)作用，有效緩解家兔離體血管條痙攣，為研究心絞痛治療藥物提供方向。這表明，廣金錢草總黃酮對心腦血管具有一定的保護(hù)作用。提示廣金錢草總黃酮對心絞痛和腦血管硬化癥等有治療意義，可供臨床參考。簡潔瑩等［32］用腦垂體后葉素作用于家兔進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，廣金錢草提取物——極性較大的黃酮可對抗T波高聳和S-T段上移，因此有理由認(rèn)為極性較大的黃酮能克服心律不齊和結(jié)性早搏現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)極性較大的黃酮對心率減慢有對抗作用。

2.5 消炎止痛 顧麗貞等［33］發(fā)現(xiàn)廣金錢草黃酮及酚酸物對組胺引起的血管通透性增加效應(yīng)、巴豆油引起的小鼠耳部炎癥、棉球肉芽腫均有明顯的抑制作用，但對由蛋清引起的大鼠關(guān)節(jié)腫脹抑制作用甚微。在一定意義上證實(shí)廣金錢草總黃酮及酚酸物對急性炎癥和慢性炎癥都具有一定抗炎作用。盧兗偉等［27］對于10%新鮮蛋清所致的大鼠足跖炎癥，在致炎前灌服總黃酮能明顯抑制足跖腫脹，提示廣金錢草總黃酮具有消炎作用。而對于用乙酸注入小鼠腹腔引起動(dòng)物疼痛反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)致痛前灌服廣金錢草總黃酮能縮短小鼠扭體反應(yīng)時(shí)間和降低扭體反應(yīng)次數(shù)，結(jié)果顯示，廣金錢草總黃酮具有一定的止痛效果。

2.6 對血液影響 李文淑等［34］在進(jìn)行廣金錢草總黃酮膠囊單次給藥的臨床耐受試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)凝血指標(biāo)出現(xiàn)異常，提示廣金錢草總黃酮膠囊可能會(huì)影響人體的凝血功能。在《中華草本》［35］有提及廣金錢草總黃酮在體外能顯著拮抗血栓形成，6.7 g·L-1對血栓長度、濕重和干重的抑制率分別為27.5%，33.8%，32.9%。

2.7 急性毒性 韋耐西等［36］通過給小鼠灌胃不同濃度的廣金錢草總黃酮，觀察并記錄小鼠活動(dòng)、精神以及死亡情況，并進(jìn)行了解剖觀察，且用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）、最大耐受量（MTD），得出結(jié)論為廣金錢草總黃酮對實(shí)驗(yàn)小鼠幾無急性毒性作用。

3 前景展望

廣金錢草是一種有顯著藥理作用和廣闊開發(fā)前景的廣西道地藥材，廣金錢草藥源豐富，成本低廉，資源優(yōu)勢明顯。廣金錢草夠能清熱祛濕、利尿通淋，常用于治療尿路感染、腎炎水腫、泌尿系結(jié)石、膽囊結(jié)石、黃疸、疳積、癰腫等［37］。其有效成分總黃酮具有抗氧化、防治腎臟草酸鈣結(jié)石形成、利尿、保護(hù)心腦血管、抗炎等功效，具有一定的臨床意義，應(yīng)用前景十分廣闊。