沙門氏菌重組酶聚合酶檢測方法的建立及應(yīng)用

劉立兵，耿云云，姜彥芬，劉思穎，孫曉霞，南匯珠，王建昌,

（1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，河北 石家莊 050051；3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024）

沙門氏菌（Salmonella）屬于腸道菌科細(xì)菌，兼性厭氧菌[1]，是一種能夠?qū)е氯诵蠊不疾〉母锾m氏陰性桿菌。在世界各國都屬于常見的食源性致病菌，在細(xì)菌性食物中毒種類中，沙門氏菌引起的食物中毒事件常被列榜首[2-3]。沙門氏菌主要通過人和動物的消化道感染致病，潛伏期通常在4～8 h，引起嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等癥狀，在從而引起食物中毒、慢性腸炎等疾??；在中國，由沙門氏菌導(dǎo)致食物中毒事件占全國食物中毒事件的40%～60%[4]；在歐洲每年有16萬多人感染沙門氏菌，發(fā)病率約為0.035%[5]；動物飼用了含有沙門氏菌的飼料，會引起雞白痢、豬霍亂等相應(yīng)的疾病，最終導(dǎo)致動物死亡[6]。因此，沙門氏菌一直是國內(nèi)外細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

沙門氏菌廣泛存在于自然界，在常溫條件下就可繁殖生長，而且對營養(yǎng)條件的要求很低，在肉類、禽類、蔬菜，蛋類、豆制品中都檢測到沙門氏菌[7-8]，其中生肉是沙門氏菌污染的主要食品[9]。目前，沙門氏菌的鑒定方法主要采用傳統(tǒng)的檢測方法[10]，分離培養(yǎng)和VITEK全自動鑒定系統(tǒng)，該方法檢測周期長，過程費(fèi)時費(fèi)力，而且菌落形態(tài)受樣品復(fù)雜程度影響較大，腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉，在檢測特異性和敏感性方面有局限性[11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，沙門氏菌的檢測方法也出現(xiàn)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[7,12]、實(shí)時熒光PCR法[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法[14]，這些方法在快速檢測和現(xiàn)場檢測方面有一定的局限性。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種新型的等溫擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)主要通過重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，在雙鏈DNA中定位同源序列，發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。

沙門氏菌的表面有很多外膜蛋白，這些蛋白與細(xì)菌進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的能力密切相關(guān)。有研究表明，沙門氏菌表面的侵襲蛋白（invasion protein，inv）起到關(guān)鍵性作用[15]。侵襲蛋白是由invA、invB、invC、invD和invE等基因編碼組成，invA為沙門氏菌的主要毒力因子，在沙門氏菌的致病過程中起到重要作用[15-16]，基于invA基因設(shè)計的引物鑒定沙門氏菌，具有屬特異性[17]。本研究以invA基因序列為靶序列，設(shè)計特異性RPA引物，建立能夠快速有效檢測沙門氏菌的RPA等溫檢測方法。

本研究建立的RPA等溫檢測方法操作簡單、反應(yīng)快速，能夠排除人為干擾、交叉污染等不可控因素對沙門氏菌檢測的影響；該方法對儀器設(shè)備要求低，不需要大型的儀器設(shè)備，適合于偏遠(yuǎn)不發(fā)達(dá)地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室對沙門氏菌的檢測。同時，也為食源性致病的鑒定和檢測提供了一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株信息Table1 Information about the strains used in this study

1.1.2 材料與試劑

蔬菜、禽類中都能檢測到沙門氏菌，而且生肉是沙門氏菌污染的主要食品[7-9]，選取生活中常食用的雞肉、羊肉和西蘭花做為模擬樣品，由本實(shí)驗(yàn)室提供。

Premix Ex Taq 寶生物工程（大連）有限公司；RAA試劑盒（基礎(chǔ)型） 浙江泰晶生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；緩沖蛋白胨水（BPW）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ABI 7500實(shí)時熒光PCR儀 美國ABI公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；NanoDrop 2000c核酸分析儀 美國Thermal公司；Fusion Fx5凝膠成像系統(tǒng) 法國Viber Lourmat公司；MIR253恒溫培養(yǎng)箱日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

以沙門氏菌invA為靶基因，參考GeneBank上序列進(jìn)行比對，確定保守序列。設(shè)計RPA特異性引物，目的片段大小為200 bp，同時參照文獻(xiàn)[18]合成沙門氏菌實(shí)時熒光PCR的引物和探針。所有引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

表2 引物探針序列Table2 Primers and TaqMan probe sequences

1.2.2 沙門氏菌的培養(yǎng)及基因組DNA提取

將沙門氏菌（CICC22956）菌株接種到10 mL的營養(yǎng)肉湯中，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18 h，取菌液進(jìn)行斜面劃線接種至沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，傳代培養(yǎng)2 次，出現(xiàn)單菌落。

取沙門氏菌純培養(yǎng)菌液1 mL加入到1.5 mL的離心管中，10 000 r/min 離心2 min，收集沉淀，將菌體沉淀按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒所述方法提取細(xì)菌DNA，立即使用或－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計測定濃度。

1.2.3 RPA方法的建立

使用R A A試劑盒（基礎(chǔ)型）配制單個反應(yīng)體系，其中10 μmol/L的RPA-F和RPA-R各2 μL，A Buffer 12.5 μL，模板1 μL，ddH2O 30 μL。將上述47.5 μL體系混勻后加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反應(yīng)管中加入2.5 μL B Buffer（280 mmol/L醋酸鎂），蓋緊后瞬時離心并渦旋后，放入38 ℃水浴鍋中反應(yīng)10、20、30 min和40 min。使用DNA純化試劑盒對RPA產(chǎn)物進(jìn)行純化，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳并在Fusion Fx5中觀察分析電泳結(jié)果。

1.2.4 實(shí)時PCR方法

按照文獻(xiàn)[18]配制沙門氏菌實(shí)時PCR體系。反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L PCR-F和PCR-R各2 μL（終濃度為0.8 μmol/L)，5 μmol/L PCR-Probe 0.9 μL（終濃度為0.18 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 6.6 μL。將上述體系充分混勻后放入ABI7500實(shí)時熒光PCR儀中，反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸35 s，35 個循環(huán)，60 ℃收集熒光信號。

1.2.5 特異性和靈敏性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2.3節(jié)建立的最佳反應(yīng)時間，以表1中所示菌株的DNA作為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定RPA反應(yīng)的特異性。

取1 mL純培養(yǎng)菌液提取的基因組DNA，進(jìn)行10 倍梯度稀釋，以1 μL為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定該方法的靈敏性。同時與已建立的實(shí)時PCR方法的敏感性作比較。

1.2.6 人工模擬污染樣品檢測

挑取培養(yǎng)的沙門氏菌單菌落于1 mL滅菌的生理鹽水試管中，振蕩混勻30 s，麥?zhǔn)蠞岫葍x測定1.00 個麥?zhǔn)蠞岫?，用生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選取10－5、10－6、10－7稀釋度的菌液200 μL涂于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，并作3 個平行，用于計算純培養(yǎng)菌的初始濃度。

取羊肉、雞肉和西蘭花樣品，經(jīng)GB 4789.4—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》驗(yàn)證3 份樣品沙門氏菌均為陰性，作為人工污染的樣品，進(jìn)行檢出限分析。選擇1～10、10～50、50～100 CFU范圍內(nèi)細(xì)菌分別添加到25 g羊肉、25 g雞肉和25 g西蘭花樣品中，再添加到225 mL沙門氏菌增菌肉湯中，37 ℃培養(yǎng)，增菌6、8 h后分別取1 mL菌液參照1.2.2節(jié)進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，取1 μL作為模板進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用1.2.3節(jié)建立的RPA方法和1.2.4節(jié)實(shí)時PCR方法，同時檢測1.2.6節(jié)人工模擬污染樣品的核酸，通過對RPA片段和實(shí)時PCR擴(kuò)增曲線的分析，完成對不同樣品、不同污染量和不同增菌時間的人工模擬污染樣品的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA反應(yīng)時間的優(yōu)化

以1 mL菌液提取的DNA為模板，進(jìn)行RPA最佳反應(yīng)時間實(shí)驗(yàn)，在200 bp處有一條特異性條帶（圖1），通過Bio1D軟件定量分析，劃定相同面積的擴(kuò)增條帶，進(jìn)行產(chǎn)物量對比分析，20 min RPA產(chǎn)物量接近10 min產(chǎn)物量的2 倍，而20 min產(chǎn)物量與30 min和40 min的產(chǎn)物量沒有顯著差異，所以本研究RPA的最佳反應(yīng)時間確定為20 min。

圖1 沙門氏菌RPA檢測時間優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of RPA reaction time for Salmonella detection

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以沙門氏菌及表1中其他26 種食源性致病菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行RPA反應(yīng)，結(jié)果表明，只有沙門氏菌出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，其他細(xì)菌均在200 bp處無擴(kuò)增條帶，說明該方法具有良好的特異性，具體結(jié)果如圖2和表1所示。

圖2 沙門氏菌RPA檢測特異性結(jié)果Fig.2 Specificity of RPA for Salmonella detection

2.3 靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提取1 mL沙門氏菌菌液的核酸，經(jīng)核酸分析儀測定質(zhì)量濃度為1.1×102ng/μL，將核酸進(jìn)行倍比稀釋至1.1×10－4ng/μL，分別進(jìn)行RPA反應(yīng)和實(shí)時PCR。結(jié)果表明，RPA反應(yīng)當(dāng)質(zhì)量濃度為1.1×10－3ng/μL時有擴(kuò)增條帶，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.1×10－4ng/μL時，無任何擴(kuò)增條帶，由此確定RPA反應(yīng)的最低檢測限為1.1×10－3ng/μL； 實(shí)時PCR在質(zhì)量濃度為1.1×10－3ng/μL時檢測結(jié)果Ct值在31，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.1×10－4ng/μL時檢測結(jié)果Ct值為35，無擴(kuò)增曲線。由此可見，RPA反應(yīng)和實(shí)時PCR的最低檢測限一致，都為1.1×10－3ng/μL（圖3）。

圖3 沙門氏菌RPA和實(shí)時熒光PCR檢測方法的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivities of RPA and real-time PCR for Salmonella detection

2.4 人工模擬污染樣品檢測結(jié)果

人工污染沙門氏菌的羊肉、雞肉和西蘭花樣品增菌后，RPA檢測結(jié)果表明，當(dāng)樣品污染量為4 CUF/25 g，接種時間為6 h，羊肉、雞肉和西蘭花均未檢出沙門氏菌，而當(dāng)接種時間為8 h時，樣品均檢出沙門氏菌；當(dāng)樣品污染量為14 CFU/25 g，接種時間為6、8 h，羊肉、雞肉和西蘭花均檢出沙門氏菌；當(dāng)樣品接種量為59 CFU/25 g，接種時間為6、8 h，所有樣品均檢出沙門氏菌。所有樣品與實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果一致，見表3。

表3 人工污染樣品RPA檢測結(jié)果Table3 Detection of RPA in artificially contaminated samples

3 討 論

在我國，每年都會發(fā)生食源性致病菌中毒事件，沙門氏菌是引起人和動物食物中毒的重要感染源，沙門氏菌的檢測在食源性致病菌的檢測中處于非常重要的位置。目前，沙門氏菌的檢測普遍采用傳統(tǒng)的檢測方法，檢測周期在4～6 d之間，檢測周期長，操作復(fù)雜，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測人員，這些都不足以滿足市場的需求。近幾年，沙門氏菌的檢測也建立了很多分子生物學(xué)的方法，如，武曉松等[7]建立了沙門氏菌PCR檢測方法，并應(yīng)用到蔬菜中沙門氏菌的檢測；杜雄偉等[13]建立了實(shí)時熒光PCR檢測肉制品中的沙門氏菌的方法；高琳等[14]建立了交叉引物等溫擴(kuò)增法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測沙門氏菌的方法。但在食源性致病菌的檢測方面，由于食品的成分復(fù)雜、食品中添加劑及培養(yǎng)基的成分復(fù)雜，都會對反應(yīng)的Taq酶的活性起到一定的抑制作用，影響反應(yīng)的擴(kuò)增效率。Jacobsen等[19]研究表明，熒光定量PCR不能有效區(qū)分死菌和活菌，所以熒光定量PCR方法不適用于檢測加熱致死的菌體的樣品；其次，這些檢測方法都需要昂貴的檢測儀器和專業(yè)的操作人員，且在快速檢測、現(xiàn)場檢測以及市場需求方面有一定的局限性。所以建立快速、精準(zhǔn)、滿足市場需求的檢測方法，對我國沙門氏菌的檢測非常重要。

RPA作為一種新型的快速檢測技術(shù)，已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域。在病毒檢測方面，Wang Jianchang等[20]建立了豬圓環(huán)2型病毒的RPA快速檢測方法，并應(yīng)用到臨床樣品的檢測；在轉(zhuǎn)基因方面，鄧婷婷等[21]應(yīng)用RPA檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的Cry1Ab/c基因；在真菌方面，Ahmed等[22]應(yīng)用RPA技術(shù)檢測致病性鉤端螺旋體（pathogenic Leptospira）；在細(xì)菌方面，Euler等[23]應(yīng)用RPA技術(shù)檢測兔熱病桿菌（Francisella tularensis）。在寄生蟲[24-26]、食品安全[27]、生物安全[28]和癌癥[29]等方面RPA技術(shù)都已經(jīng)有研究。RPA是一種等溫擴(kuò)增技術(shù)，具有試劑易于保存、反應(yīng)時間較短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，并且對儀器設(shè)備要求較低，在水浴鍋、保溫杯，甚至手中即可進(jìn)行反應(yīng)[30]，適合于食源性致病菌的檢測，也便于推廣到儀器設(shè)備比較匱乏的基層檢測機(jī)構(gòu)。

沙門氏菌invA基因具有屬特異性，常作為沙門氏菌研究的靶基因，如Radhika等[31]根據(jù)invA基因設(shè)計了特異性檢測致病性沙門氏菌的引物，并在非沙門氏菌中沒有檢測到invA基因；龐心怡等[32]根據(jù)invA基因建立的LAMP檢測方法，比PCR方法的靈敏度高100 倍；魏瓊[33]根據(jù)沙門氏菌的invA基因，建立了沙門氏菌、志賀菌和金黃色葡萄球菌的三重?zé)晒舛縋CR。本實(shí)驗(yàn)選擇invA基因作為沙門氏菌檢測的靶基因，設(shè)計特異性引物，建立了沙門氏菌的RPA檢測方法，即38 ℃水浴鍋反應(yīng)20 min完成檢測，特異性強(qiáng)，靈敏性達(dá)到1.1×10－3ng/μL。人工污染樣品結(jié)果表明，經(jīng)過8 h就可完成不同濃度沙門氏菌的檢測。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法、實(shí)時熒光PCR法及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法相比，節(jié)約了成本、減少了反應(yīng)時間、縮短了檢測周期，RPA方法適合于食品中沙門氏菌的快速檢測。RPA檢測方法的建立，為食源性致病菌中沙門氏菌的檢測提供了新的技術(shù)方向，對我國食品安全監(jiān)控和進(jìn)出口食品的檢驗(yàn)具有重要意義。