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    應(yīng)用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)分析中波紫外線對(duì)HaCaT細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響

    2019-01-28 01:02:52胡中華
    實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:基因功能角質(zhì)探針

    楊 玲,許 速,胡中華

    皮膚在接受一定累積劑量的紫外線輻射后可發(fā)生一系列細(xì)胞內(nèi)變化,如細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氧化應(yīng)激標(biāo)志物(8-氧-鳥核苷、異前列烷、硝基酪氨酸等)水平升高、細(xì)胞核染色體斷裂和線粒體DNA突變等,從而激活與炎癥或腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá),最終啟動(dòng)皮膚的損傷、衰老甚至癌變等過程[1]。近年來,微小RNA(microRNA,miRNA)逐漸引起各相關(guān)領(lǐng)域的重視,許多研究表明miRNA在細(xì)胞的增殖、分化與凋亡、生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫反應(yīng)以及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。為探討miRNA在紫外線引起皮膚光損傷機(jī)制中的作用,本研究利用生物芯片技術(shù)檢測(cè)中波紫外線(ultraviolet B,UVB)輻照人角質(zhì)形成細(xì)胞的miRNA表達(dá),并應(yīng)用基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異miRNAs的靶基因功能,以期從miRNA組學(xué)水平探討UVB致皮膚光損傷的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞,昆明懷天科技有限公司)。miRNA抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司),miRNA標(biāo)記和雜交試劑盒、基因表達(dá)洗滌緩沖液(美國(guó)Agilent公司);Agilent Bioanalyzer 2100電泳分析儀、Nano Drop ND-2000分光光度計(jì)、滾動(dòng)雜交爐、微陣列掃描儀(美國(guó)Agilent公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HaCaT細(xì)胞以DMEM(高糖)培養(yǎng)基調(diào)整濃度為105/ml~106/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,待其貼壁后用于后續(xù)觀察及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。將亞融合狀態(tài)的細(xì)胞分為對(duì)照組和照光組,輻照前各孔細(xì)胞均棄去培養(yǎng)基,加磷酸鹽緩沖液(PBS)覆蓋,輻照后棄去PBS并加相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)UVB照射劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下:①未處理組;②100 mJ/cm2UVB組;③200 mJ/cm2UVB組;④400 mJ/cm2UVB組,并設(shè)定12 h、24 h為檢測(cè)時(shí)相點(diǎn)。

    1.2.2 miRNA的抽提、純化與標(biāo)記 根據(jù)miRNA抽提試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的總RNA抽提,經(jīng)電泳質(zhì)檢合格后備用。實(shí)驗(yàn)樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的試劑盒,按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)樣品miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記和雜交。雜交條件如下:在滾動(dòng)雜交爐中,55℃ 20 r/min,滾動(dòng)雜交20 h,雜交完成后洗片。按上述流程共完成7張人miRNA (8×60K)V21.0芯片的處理。

    1.2.3 芯片掃描 應(yīng)用Agilent微陣列掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描,掃描分辨率(scan resolution)=3 μm。 用 Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數(shù)據(jù),最后采用R語(yǔ)言程序包AgiMicroRna進(jìn)行歸一化處理,所用的算法為Quantile。

    1.2.4 差異miRNAs篩選 選擇倍數(shù)差異(fold change,fc)和探針檢出標(biāo)記( fl ag)兩個(gè)參數(shù)設(shè)定篩選閾值,每個(gè)處理組分別與對(duì)照組相比較進(jìn)行差異miRNA篩選,且至少一組內(nèi)不出現(xiàn)fl ag 為A(A 表示該探針信號(hào)值與背景信號(hào)值無明顯差異,P 表示該探針信號(hào)值與背景信號(hào)值有顯著差異)的探針,若設(shè)定篩選閾值為fc2,則兩組比較的倍數(shù)值為≥2 倍(上調(diào)差異miRNA)或≤0.5 倍(下調(diào)差異miRNA),將上述數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后繪制散點(diǎn)圖。若設(shè)定篩選閾值為fc3,篩選表達(dá)變化更有顯著的差異miRNA,則兩組比較的倍數(shù)值為≥3 倍(上調(diào)差異miRNA)或≤0.33 倍(下調(diào)差異miRNA),即差異miRNA表達(dá)更為顯著,以上篩選結(jié)果可在miRBase序列數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址http://mirbase.org/)中查詢其相關(guān)信息。

    1.2.5 差異miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 采用Target Scan7.0進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)閾值為保留total context ++ score<-0.2的結(jié)果,并進(jìn)行基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)的靶基因功能的富集分析。

    1.2.6 GO富集分析 采取的方法是 fi sher精確檢驗(yàn),數(shù)據(jù)包是clusterPro fi ler,來自R/bioconductor,挑選的標(biāo)準(zhǔn)是落在某個(gè)term/GO 上差異的基因數(shù)目≥2且P<0.05,并按照富集因子(enrich factor)的值從大小降序排列,取前30個(gè)結(jié)果繪圖。

    2 結(jié)果

    2.1 UVB處理HaCaT細(xì)胞的miRNA表達(dá)

    差異倍數(shù)fc是由各處理組與對(duì)照組信號(hào)值比較所得,首先設(shè)定篩選閾值為fc2,圖1為100 mJ/cm2、200 mJ/cm2和400 mJ/cm2UVB處理HaCaT細(xì)胞12 h和24 h后的差異miRNA表達(dá)情況,其中上調(diào)表達(dá)miRNA為≥2 倍,下調(diào)表達(dá)miRNA為≤0.5 倍。圖1提示不同劑量UVB處理HaCaT細(xì)胞后均出現(xiàn)差異miRNA表達(dá),其中400 mJ/cm2UVB處理后的HaCaT細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA最為明顯。

    圖1 UVB處理HaCaT細(xì)胞的miRNA表達(dá)

    圖2為fc閾值下的差異miRNA散點(diǎn)圖分布。x軸表示該探針集在對(duì)照組樣本芯片中標(biāo)準(zhǔn)化后的信號(hào)值,y軸表示該探針集在處理組樣本芯片中標(biāo)準(zhǔn)化后的信號(hào)值,圖中每一個(gè)點(diǎn)代表芯片上的一個(gè)探針集,落在圖形中y=x直線上的點(diǎn),代表該探針在兩組樣本內(nèi)的信號(hào)值無差異,落在圖形中y=x直線兩側(cè)有顏色區(qū)域的點(diǎn),代表該探針在兩組樣本內(nèi)的信號(hào)值有差異,紅色點(diǎn)代表上調(diào)表達(dá)的差異miRNA,藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)表達(dá)的差異miRNA。圖2提示各處理組和對(duì)照組數(shù)據(jù)總體分布比較集中,信號(hào)值分布與圖1一致。

    根據(jù)圖1和圖2提示,400 mJ/cm2UVB處理組的差異miRNA表達(dá)最為顯著,將該組(包括12 h和24 h)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)定篩選閾值為fc3,篩選表達(dá)變化更為顯著的差異miRNA,即兩組比較的倍數(shù)值為≥3 倍(上調(diào)差異miRNA)或≤0.33 倍(下調(diào)差異miRNA),具體見表1。

    2.2 差異miRNA的靶基因功能分析

    主要針對(duì)400 mJ/cm2UVB組的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及GO富集分析 根據(jù)富集因子(enrich factor)的值從大小降序排列,并進(jìn)行分析(圖3)。圖3提示部分靶基因功能涉及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、T淋巴細(xì)胞耐受、B淋巴細(xì)胞分化、自然殺傷細(xì)胞增殖、樹突細(xì)胞抗原處理提呈、免疫球蛋白產(chǎn)生以及中性粒細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等。

    表1 400 mJ/cm2 UVB處理細(xì)胞后表達(dá)變化顯著的差異miRNA

    圖2 UVB處理HaCaT細(xì)胞的差異miRNA信號(hào)值分布圖

    3 討論

    miRNA屬于非編碼RNA的一類,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)每個(gè)miRNA均有眾多的靶基因,而每個(gè)基因的mRNA又有可能受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控,由此構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理論基礎(chǔ)[3]。一般認(rèn)為其對(duì)靶基因的調(diào)控主要發(fā)生在翻譯水平,影響基因表達(dá)的機(jī)制是miRNA與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)(UTR)不完全互補(bǔ)結(jié)合,影響mRNA的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性,或直接調(diào)控翻譯過程,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[4]。

    圖3 400 mJ/cm2 UVB處理組差異miRNA靶基因功能的GO富集

    針對(duì)皮膚光損傷的機(jī)制研究多集中于炎性因子或炎癥遞質(zhì)參與的信號(hào)通路,為了探討其miRNA調(diào)控機(jī)制,本研究以不同強(qiáng)度UVB輻照HaCaT細(xì)胞,在12 h和24 h檢測(cè)細(xì)胞miRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度UVB作用后的不同時(shí)間點(diǎn)HaCaT細(xì)胞均有明顯的miRNA差異表達(dá),且以高能量強(qiáng)度UVB條件下變化最為顯著。說明隨著UVB強(qiáng)度及時(shí)間的變化,有越來越多的miRNA參與到UVB對(duì)細(xì)胞機(jī)能影響的調(diào)控中。該結(jié)果與既往研究基本一致[5],可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。進(jìn)一步設(shè)定更為嚴(yán)格的fc3閾值篩選出9個(gè)表達(dá)變化明顯的miRNAs,其中上調(diào)表達(dá)的為miR-8063、miR-1273f、miR-4497、miR-4778-5p和miR-6510-5p,下調(diào)表達(dá)的為miR-1973、miR-5100、miR-205-3p和miR-4485-3p。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),上述miRNAs有的參與了炎癥的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)歸過程,如miR-8063在感染(如肺部感染、皮膚感染等)引起的敗血癥患者血清中均有差異表達(dá),并對(duì)判斷疾病的預(yù)后有一定的提示作用[6];miR-6510-5p在銀屑病皮損中的差異表達(dá)提示其參與銀屑病發(fā)生、發(fā)展調(diào)控[7]。其他的miRNAs則集中于腫瘤研究領(lǐng)域,如Reshmi等[8]利用一種新的計(jì)算工具“Mpred”鑒定并驗(yàn)證了miR-1273f序列在宮頸癌組織中的表達(dá),提出其可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用的觀點(diǎn);Jima等[9]對(duì)比了miR-4497和miR-4485-3p在惡性B淋巴細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)二者在惡性B淋巴細(xì)胞中均有差異性表達(dá);miR-4778-5p在乳腺腫瘤組織中存在差異表達(dá)[10]、miR-1973在兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病中存在差異表達(dá)[11]、miR-205-3p在宮頸癌和鼻咽癌中存在差異表達(dá)[12,13],以上均提示這些miRNAs不同程度地參與了腫瘤的發(fā)病機(jī)制。此外,研究還發(fā)現(xiàn),miR-5100在干燥綜合征患者的唾液腺中差異表達(dá)[14],推測(cè)其與機(jī)體的自身免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。鑒于皮膚作為人體與外界環(huán)境的第一道屏障,且皮膚屬于人體特殊的免疫器官,因而推測(cè)上述miRNAs在UVB誘導(dǎo)的皮膚致炎、致瘤以及免疫應(yīng)答等過程中也具有重要的調(diào)控作用,并提示其可能是UVB致角質(zhì)形成細(xì)胞病變的機(jī)制之一,值得進(jìn)一步研究和探索。

    GO是一個(gè)在生物信息學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的本體,用于提供一個(gè)可具代表性的規(guī)范化的基因和基因產(chǎn)物特性的術(shù)語(yǔ)描繪或詞義解釋的工作平臺(tái),其涉及的基因和基因產(chǎn)物涵蓋生物學(xué)的三個(gè)方面:細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)。通過將差異基因做GO富集分析,可以把基因按照不同的功能進(jìn)行歸類,并對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類,從而為繼續(xù)進(jìn)行通路分析打下基礎(chǔ)[15]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)UVB誘導(dǎo)的差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行功能富集分析和分類,發(fā)現(xiàn)一部分差異基因的功能涉及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、T淋巴細(xì)胞耐受、B淋巴細(xì)胞分化、自然殺傷細(xì)胞增殖、樹突細(xì)胞抗原處理提呈、免疫球蛋白產(chǎn)生以及中性粒細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方面,進(jìn)一步說明UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞差異miRNA的靶基因直接或間接參與了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫過程,并最終調(diào)控致炎或致瘤的病理過程。

    綜上所述,本研究利用miRNA 表達(dá)譜芯片篩選了UVB輻照HaCaT細(xì)胞的差異miRNA,并應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析了UVB致角質(zhì)形成細(xì)胞損傷過程中可能起顯著作用的靶基因功能,為UVB致皮膚病變的機(jī)制研究提供了一些理論基礎(chǔ)。但本研究尚處于初步探索階段,還存在一些不足之處:其一,HaCaT細(xì)胞是經(jīng)特殊培養(yǎng)條件誘導(dǎo)后永生化的細(xì)胞株,從基因調(diào)節(jié)方面看這種細(xì)胞與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比有一定的差別,由此得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推導(dǎo)延伸至正常表皮細(xì)胞,其準(zhǔn)確性及代表性有所偏差,下一步可利用原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞驗(yàn)證上述結(jié)果的可信度。其二,miRNA參與細(xì)胞的基因調(diào)控過程,涉及從基因表達(dá)到核酸轉(zhuǎn)錄再到蛋白質(zhì)翻譯直至產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)等一系列復(fù)雜的中間環(huán)節(jié),期間的影響因素錯(cuò)綜復(fù)雜。本研究應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA的靶基因功能進(jìn)行了初步分析,所涉及的靶基因功能較為寬泛,下一步實(shí)驗(yàn)研究可選定某幾個(gè)miRNA片段與細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)性進(jìn)行研究,從而為UVB損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的HaCaT細(xì)胞的miRNA調(diào)控機(jī)制積累更有意義的結(jié)論。

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