細胞替代療法研究進展

楊雯雋 胡蘋

細胞是生物體的基本功能和結構單位，幾乎所有的人類疾病都涉及到細胞病變導致的功能紊亂與喪失。因而所有疾病治療方法的根本原則都是采用各種化學和物理的方法清除不正常細胞，促進細胞正常功能的恢復。隨著細胞生物學的發(fā)展，細胞替代治療方法（cell replacement therapy）與策略應運而生。細胞替代療法是指直接將細胞作為一種藥物，通過細胞移植的方法，用健康的細胞替代病變細胞對各種疾病進行治療的方法和策略。細胞替代療法直接針對疾病產(chǎn)生的根源，理論上能夠治療所有的疾病，因而給帕金森綜合征（Parkinson disease，PD）、肌營養(yǎng)不良癥、惡性腫瘤等目前缺乏有效治療方法的退行性疾病和惡性病變的治療帶來了革命性的突破。

1 細胞替代治療中的細胞來源

1.1 功能細胞移植

細胞替代治療最直接的思路是用健康的功能細胞替代相應的病變細胞，例如用功能正常的肌肉細胞替代病變的肌肉細胞，治療各種肌營養(yǎng)不良癥；用功能正常的多巴胺能神經(jīng)元替代病變壞死的多巴胺能神經(jīng)元，治療帕金森綜合征等。輸血就是典型的功能細胞移植替代療法。通過輸血可以將紅細胞等功能細胞移植入患者體內(nèi)，行使其功能，從而達到挽救生命的目的。這一策略的優(yōu)點是在邏輯上簡單直接，“頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳”，可以極大地簡化治療策略的設計，減少外在治療干預對全身各非病變組織器官的干擾，降低治療的副作用。缺點是體內(nèi)的很多功能細胞，例如肌肉細胞、神經(jīng)元細胞、紅細胞等血液細胞等都是有絲分裂后細胞（post mitotic cells），不具有自我增殖能力。對于這些細胞而言，移植的健康細胞一旦死亡，細胞替代療法的療效即喪失，需要再次進行細胞移植。例如，輸血后獲得的紅細胞等功能細胞能替代2～4周，無法長期維持患者機體的需求。

如何獲得大量的用于移植的具有完整功能的功能細胞一直是細胞生物學研究領域重要的基本的科學難題，也是通過直接移植健康功能細胞進行細胞替代治療的主要技術瓶頸之一。即使是在非有絲分裂后的功能細胞，在體外的擴增能力也比較弱，且在體外擴增后還保持良好功能的能力更弱。如何實現(xiàn)功能細胞的擴增與功能保持是細胞替代治療中亟待解決的主要問題之一。

1.2 胚胎干細胞與誘導多能干細胞移植

干細胞具有自我更新能力，且能夠分化為多種功能細胞，是進行細胞移植的重要供體細胞來源。根據(jù)分化能力及存在時間的不同，干細胞可以分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell）兩種類型。顧名思義，胚胎干細胞是指從早期胚胎中分離出來的一類細胞，僅存在于胚胎發(fā)育早期。這類細胞具有在體外無限增殖、自我更新的能力，能夠分化為人體幾乎所有的細胞類型。ESC的發(fā)現(xiàn)為細胞治療的廣泛應用奠定了基礎。理論上，經(jīng)過適當?shù)恼T導，ES細胞可以分化為細胞替代療法所需的幾乎所有細胞類型，因而能夠解決細胞替代療法中的細胞來源問題。同時，ESC能夠在體外無限增殖，提供足量的細胞用于獲取功能細胞。從ESC中，我們已經(jīng)成功分化出了神經(jīng)元細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、胰島細胞等多種細胞類型。但是，目前ESC向很多細胞類型的分化效率還有待提高，分化細胞的功能也有待進一步完善。這也是目前干細胞研究的一個重要方向。ESC雖然有很強的應用潛能，但是ESC在移植后具有致瘤性。如何降低ESC的致瘤性及提高ESC安全性是干細胞研究中的另一個關鍵問題。

ESC的獲取涉及到胚胎操作，會產(chǎn)生一定的倫理爭議。日本科學家中山伸彌（Shinya Yamanaka）團隊在2007年首次通過過表達Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四個轉錄因子將人成纖維細胞誘導為多能干細胞，實現(xiàn)體細胞重編程，獲得誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。隨后，科學家們在血細胞、角質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、胰島β細胞、肝細胞和胃上皮細胞等多數(shù)體細胞類型中過表達Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4個轉錄因子都獲得了iPSCs。進一步的研究表明，上述4個轉錄因子并非誘導體細胞重編程的唯一組合，其他轉錄因子、小分子也可以誘導iPSCs的產(chǎn)生。通過小分子誘導得到的iPSCs避免了過表達外源基因造成的安全性隱患，為iPSCs在細胞替代治療中的應用奠定了基礎。但是，致瘤性、分化效率低等問題依然存在，需要通過進一步的研究加以解決。

1.3 成體干細胞

成體干細胞是指存在于成年個體體內(nèi)的一類干細胞。成體干細胞分布于多種已經(jīng)分化的組織類型中。目前，已經(jīng)在肌肉、血液、神經(jīng)、皮膚、脂肪、骨髓、肝、小腸、乳腺、牙齒等組織器官中鑒定到成體干細胞的存在。這類干細胞在成體組織中數(shù)量很少，通常處于靜息狀態(tài)，在組織生長與損傷修復中被激活，通過擴增與分化，在組織再生中發(fā)揮決定性作用。這類細胞具有自我更新能力，能夠分化為所處組織器官中的一種或幾種細胞類型。例如肌肉干細胞能夠分化為肌肉細胞，血液干細胞能夠分化為紅細胞、血小板、淋巴細胞等存在于血液中的功能細胞，神經(jīng)干細胞能夠分化為神經(jīng)元細胞等。成體干細胞沒有致瘤性，源于患者自身，移植時沒有組織相容性問題，能夠大大降低免疫排斥反應。成體干細胞不涉及到胚胎操作問題，倫理爭議較少。由于成體干細胞具有上述優(yōu)點，因而當前在臨床上具有比ESCs和iPSCs更廣泛的應用。

然而，成體干細胞的應用目前還存在一些瓶頸問題。首先，多數(shù)成體干細胞在體外擴增困難。例如造血干細胞和肌肉干細胞都在體外難以擴增，每次移植均需要供體提供大量組織進行干細胞的分離與富集，因而對供體造成傷害。因此，建立成體干細胞體外規(guī)模擴增技術是成體干細胞用于細胞替代療法的重要技術基礎。通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，我們研究組將肌肉干細胞在體外擴增 1×107～1×109倍，為肌肉干細胞用于細胞替代療法奠定了基礎。對各種成體干細胞微環(huán)境的研究與模擬有望推動多種成體干細胞體外擴增系統(tǒng)的建立。其次，成體干細胞在病理和衰老條件下會發(fā)生多種性質(zhì)變化。例如，衰老的肌肉干細胞增殖能力顯著降低，移植后是否能夠在受體中有效行使功能目前還不是很清楚。第三，由于移植的細胞不是直接行使功能，患者體內(nèi)病理條件下的微環(huán)境可能會導致移植的干細胞功能降低甚至喪失。例如，病變肌肉會產(chǎn)生多種因子，阻礙肌肉干細胞的增殖、分化和存活。如何改善受體微環(huán)境，以提高移植細胞在受體中的定植能力與功能，是當前細胞替代療法亟需解決的重要科學問題。

1.4 轉分化來源細胞

細胞具有一定的可塑性。在恰當?shù)恼T導條件下，細胞可以不需要回到ESC階段，直接轉變?yōu)榱硪活惣毎瑢崿F(xiàn)細胞的轉分化。例如，早在20世紀80年代，過表達轉錄因子MyoD可以使成纖維細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞等多種非肌肉細胞轉變?yōu)榧∪忸愃萍毎?。隨后的研究表明，過表達不同的轉錄因子組合，可以實現(xiàn)成纖維等細胞類型向肝、神經(jīng)、心肌細胞等多種細胞類型的轉分化。這些轉分化得到的細胞在體外和體內(nèi)都具有一定的功能，成為細胞替代治療的潛在細胞來源。但是，由于涉及到一種或多種外源轉錄因子的過表達，所以在臨床應用中存在安全性風險。

為了解決這一問題，近年來小分子誘導的轉分化系統(tǒng)取得了很大的發(fā)展。用小分子取代外源轉錄因子的過表達，誘導轉分化的發(fā)生，避免了引入外源因子，提高了所獲得的細胞的安全性。通過各種小分子組合，已經(jīng)實現(xiàn)了從成纖維細胞向肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞等細胞類型的轉分化。獲得的細胞在體外、體內(nèi)均具有一定的功能。

轉分化所得的細胞具有取材容易的優(yōu)點，但是轉分化所得細胞的功能還需要進一步完善。探索優(yōu)化轉分化條件，建立更高效、功能更優(yōu)的轉分化系統(tǒng)是干細胞研究的一項重要內(nèi)容。

功能細胞、ESC/iPSC、成體干細胞、分化和轉分化來源的細胞作為細胞替代療法的細胞來源各有優(yōu)勢，同時也各自面臨一些瓶頸問題，需要通過進一步的研究工作解決。本文將總結應用上述來源細胞對來源于內(nèi)、中、外三個胚層的不同組織器官的病變、損傷進行細胞替代治療的進展。

2 細胞替代療法治療疾病

2.1 細胞替代療法在肝臟疾病治療中的應用

長期以來，針對終末期的肝臟疾病，急性肝損傷，肝臟移植都是唯一的治療方法。但由于供體肝源獲得困難，供體和受體之間存在排異的問題，使這一方法的應用受到限制。細胞替代療法可以有效地替代現(xiàn)有的肝移植，起到治療多種肝臟疾病的作用。

最早的細胞替代治療是肝細胞轉輸。早在1976年，Matas等就以Gunn（先天 UDPGT酶缺失）為模型，通過肝細胞回輸?shù)姆绞接行У馗纳屏嗽撔∈骍DPGT酶的產(chǎn)生，并降低了小鼠血液中的血漿膽紅素的濃度。

基于肝細胞回輸?shù)母闻K疾病治療，目前通用的方法是將肝實質(zhì)細胞通過肝臟門靜脈或者其他途徑回輸?shù)礁闻K中，再通過補充外源性具備功能的肝細胞，達到維持肝臟功能的目的。肝細胞回輸，雖然已在小鼠等模式生物上有了較好的研究成果，但在臨床上，肝實質(zhì)細胞來源稀缺，分離困難，且體外培養(yǎng)難度大，對細胞凍存的過程又十分敏感，使用肝臟實質(zhì)細胞進行細胞回輸治療仍然有很多問題需要解決。

ESCs和iPSCs誘導分化為肝細胞是肝臟疾病細胞替代治療的一個選擇。利用成纖維細胞誘導成為肝實質(zhì)細胞是肝臟疾病細胞替代治療的另一個選擇?；堇F隊通過過表達轉錄因子，將人和小鼠成纖維細胞轉分化為功能性肝實質(zhì)細胞，并在臨床上應用于生物人工肝。丁勝團隊亦成功地利用成纖維細胞誘導出了肝實質(zhì)細胞。鄧宏魁團隊則通過小分子同時誘導HNF1A、HNF4A、HNF6、ATF5、PROX1和CEBPA的表達，成功地將成纖維細胞誘導稱為肝實質(zhì)細胞。這些誘導方法的建立為肝臟疾病的細胞替代治療奠定了基礎。

簡而言之，肝臟的細胞代替治療能有效地解決目前供體肝臟稀缺的問題。針對包括急性肝損傷在內(nèi)的疾病，肝臟細胞回輸都能起到很好的治療效果。

2.2 細胞替代療法在胰腺疾病治療中的應用

近年來，糖尿病呈現(xiàn)高發(fā)趨勢。中國是糖尿病患者人數(shù)最多的國家，2017年患病人數(shù)達到1.14億。雖然胰島素注射可以極大地幫助糖尿病患者控制血糖，但是依然存在很多問題。通過胰腺器官移植或胰島移植的方法理論上可以達到不使用胰島素而使病情獲得良好控制的目的，并解決胰島素注射中存在的血糖濃度難以動態(tài)調(diào)控等問題。胰腺移植已經(jīng)在臨床上應用于I型糖尿病的治療，并取得了一定的療效。但是，由于胰腺的供體非常少，阻礙了這一技術的廣泛應用。細胞替代療法可以幫助解決供體不足的問題。

目前主要通過人源 ESCs/iPSCs分化產(chǎn)生功能性β細胞，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來重現(xiàn)胰島中復雜三維結構及其構成要素。由iPSCs分化得到的胰島素分泌細胞（類β細胞）能夠在體外產(chǎn)生胰島素，并在動物模型中改善高血糖癥（hyperglycemia）。從 ESCs/iPSCs分化得到類 α-、β-、δ-等多種激素分泌細胞類型，其與內(nèi)皮細胞共同形成類器官（organoid）后移植入動物體內(nèi)，在動物模型中具有葡萄糖響應功能。通過3D培養(yǎng)、類器官形成等方法，應用多種細胞類型模擬體內(nèi)胰島的結構和功能是當前研究的重要方向。移植細胞在體內(nèi)的定植是另一個需要解決的問題。采用組織工程的方法把移植的細胞或類器官包裹在特殊材料的微型膠囊裝置里，一方面可以提供激素分泌功能，另一方面可以限制免疫細胞的攻擊，提高移植細胞的定植能力。這一方法目前已有一些臨床試驗的報道。

2.3 細胞替代療法在血液系統(tǒng)疾病和腫瘤治療中的應用

輸血是最早出現(xiàn)的細胞替代療法。早在19世紀，歐洲的醫(yī)生們就開始通過輸血嘗試治療各種嚴重失血。到20世紀初，現(xiàn)代輸血技術基本建立。直到今天，以輸血為代表的功能細胞替代療法依然是嚴重失血患者的主要治療方式。

由于血液譜系細胞獲取相對比較容易，結合長期輸血實踐獲得的大量臨床經(jīng)驗，細胞移植等技術相對成熟，因而以血液譜系相關細胞移植為代表的細胞替代療法在血液疾病的治療中占據(jù)重要地位。紅細胞、白細胞和血小板是功能細胞替代療法的主要細胞類型。

ESCs/iPSCs可以在體外誘導為紅細胞、T細胞、血小板等功能細胞。但是，人源血液干/祖細胞向T細胞分化時，分化效率還較低、分化效果不穩(wěn)定，重復性需要進一步提高。目前應用更多的是向從臍帶血中分離出的血液干/祖細胞添加多種細胞因子，使其向 T細胞誘導分化。這一分化系統(tǒng)中分化出的 T細胞已經(jīng)在多個臨床試驗中用于替代患者體內(nèi)的T細胞，以治療多種白血病。目前已經(jīng)建立了用于向 T細胞分化的統(tǒng)一的臨床級iPS細胞系，為其臨床應用奠定了基礎。從iPSCs分化為T細胞的方法在進行基因編輯時有較大的優(yōu)勢。由于在iPSCs中進行基因編輯較為方便，并且編輯過的iPSCs能夠在體外大量擴增，因而是制備CAR-T細胞的最佳選擇。

從臍帶血中分離純化的血小板，通過血小板輸注，在臨床上已經(jīng)用于治療大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa）、Gaucher氏癥。

除了進行終末分化的功能細胞的替代之外，也可用健康的 HSCs替代患者體內(nèi)病變的HSCs，或者由移植的健康的 HSCs在患者體內(nèi)產(chǎn)生健康的血液譜系的所有細胞，替代病變的下級細胞。這種方法已經(jīng)被廣泛用于白血病的治療。用于移植的 HSCs主要來源于捐獻骨髓的供體，少量HSCs可以從臍帶血中分離而獲取。HSCs細胞替代療法在免疫缺陷疾病和腫瘤中也開始有一些初步的嘗試。像多數(shù)成體干細胞一樣，HSCs在體外無法擴增。通過添加維生素 A、視黃酸等因子，結合微載體與3D培養(yǎng)，HSCs可以得到部分擴增。提高HSCs在體外的擴增能力是 HSCs細胞替代療法的重要研究方向。

HSCs可以通過由ESCs/iPSCs分化而來；還可以通過轉分化以獲得。這些通過不同方式獲得的HSCs在體內(nèi)的功能完整性及安全性等方面尚需通過進一步的研究加以證實。

2.4 細胞替代療法在心臟疾病治療中的應用

人ESCs/iPSCs可以在體外誘導分化為心肌前體細胞以及起搏細胞（pacemaker cells）、心室細胞（ventricular cells）、心房細胞（atrial cells）等終末分化的細胞類型。應用這些體外分化得到的細胞在動物模型，以及豬和非人靈長類大動物心梗模型中取得了比較好的療效。在非人靈長類心梗模型[短尾猿（macaque monkeys）心梗模型]中，從人ESCs分化來的心肌細胞在移植后能夠存活，定植3個月后，可顯著提高左心室功能。人ESCs分化得到的臨床級心血管前體細胞在初期臨床試驗中取得了一定的療效。

心肌細胞也可以通過體內(nèi)和體外轉分化獲得，并能夠在心梗動物模型中緩解癥狀。心血管疾病的細胞替代治療中還存在很多有較大爭議的領域和待解決的問題，更深入的研究會對這些問題的解決提供幫助。

2.5 細胞替代療法在骨骼肌疾病治療中的應用

各種肌營養(yǎng)不良、肌無力等肌肉退行性疾病及嚴重損傷造成的骨骼肌缺損目前均缺乏有效的治療方法。細胞替代療法為這類疾病的治療帶來了新的希望。

與其他功能細胞類似，骨骼肌細胞可以從ESCs/iPSCs誘導獲得。目前已經(jīng)建立了來源于杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）、假肥大型肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）、肢帶型肌營養(yǎng)不良（limbgirdle musculardystrophy，LGMD）、面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（facioscapulohumeral muscular dystrophy，F(xiàn)SHD）、強直性肌萎縮1（myotonic dystrophy 1，DM1）等肌肉退行性疾病患者的iPSCs。這些iPSCs的建立為進一步的基因校正奠定了基礎。

由于iPSCs具有致瘤性，因此難以作為細胞替代療法的種子細胞進行直接移植。應用iPSCs進行各種肌肉退行性疾病的細胞替代治療需要首先把 iPSCs誘導分化為肌肉譜系的細胞，然后進行移植。通過模擬體內(nèi)骨骼肌的發(fā)育過程，ESCs/iPSCs可以分化為肌肉細胞。基因校正后的iPSCs在體外進一步分化為肌肉前體細胞后，移植入 DMD小鼠模型中，使肌肉功能得到部分恢復。目前使用這一策略獲得肌肉細胞的主要問題是分化效率不高、分化系統(tǒng)不穩(wěn)定、批次之間差異較大。分化所得的肌肉譜系的細胞功能不完整、不穩(wěn)定，因此需要有進一步的研究工作，以提高分化效率和分化系統(tǒng)的穩(wěn)定性，加強分化細胞的功能。

肌肉干細胞（肌衛(wèi)星細胞）是具有肌肉分化潛能的一類成體干細胞。肌肉干細胞位于肌膜與基底膜之間，通常處于靜息狀態(tài)。在肌肉生長和損傷修復的時候，肌肉干細胞被激活。激活的肌肉干細胞能夠進行擴增，并分化為具有功能的肌肉細胞。由于肌肉干細胞完全不具有致瘤性，能夠高效分化為有功能的肌肉細胞，并在體內(nèi)具有較高的整合效率，是進行各種肌肉相關疾病細胞替代療法的理想的種子細胞。肌肉干細胞在體外擴增困難，在體外培養(yǎng)超過 24 h后，喪失幾乎全部的干性，移植入體內(nèi)后無法定植分化為肌肉細胞。通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，我們研究組建立了肌肉干細胞在體外長期高效擴增的系統(tǒng)。這一系統(tǒng)的建立，為肌肉干細胞于肌肉相關疾病的細胞替代治療方面的應用奠定了基礎。

除了肌肉干細胞之外，還有一些細胞在體外具有肌向分化潛能。例如，肌肉間質(zhì)細胞、FAPs（fibrocyteladipocyte progenitors）、side population cells、血管內(nèi)皮細胞（pericytes）都在體外表現(xiàn)出一定的肌肉分化潛能。針對這些細胞進行肌肉相關疾病的細胞替代治療，我們也開展了一些臨床試驗。這些細胞在體內(nèi)是否具有肌向分化潛能，體內(nèi)分化細胞的功能如何，還有待進一步研究。

2.6 細胞替代療法在腎臟疾病治療中的應用

慢性腎病嚴重危害人類健康，目前針對腎病最有效的治療方案是腎臟移植，但是移植器官的供應遠遠落后于需求。

細胞替代療法可以通過補充腎臟細胞，進而重建腎臟功能。ESCs/iPSCs均具有腎細胞分化能力，體外誘導分化形成腎前體細胞（nephron progenitorcells）和腎小管細胞。應用三維培養(yǎng)技術，ESCs/iPSCs可以在體外形成腎類器官。腎臟中是否存在干細胞目前還有很大的爭議。我們也可以通過轉分化的方法獲得腎細胞。目前用于細胞替代療法實驗的主要還是由ESCs/iPSCs分化來的腎細胞。生物人工腎（bioartificial kidney，BAK）或稱腎小管輔助裝置（bioartificial renal tubule assistdevice，RAD）是指在高流量的、具有血液過濾裝置的、空心纖維管道的內(nèi)面加入一層纖維膜，經(jīng)過人工合成的細胞外基質(zhì)蛋白預處理，種植哺乳類（如豬）腎小管上皮細胞，這些細胞逐漸同單層細胞融合并生長，起到腎臟的作用。在狗尿毒癥實驗中證實，RAD具有腎臟的轉運、重吸收、代謝和內(nèi)分泌功能。但這一細胞治療方案的安全性還有待評估。

2.7 細胞替代療法在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應用

細胞替代療法為阿爾茲海默病和帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了新的思路。ESCs/iPSCs可以在體外誘導分化為神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元/小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)滋養(yǎng)細胞，用于細胞替代治療。從iPSCs誘導分化而來的神經(jīng)星形膠質(zhì)細胞（astrocytes）已經(jīng)在 I/IIa期臨床試驗中用于治療 ALS，通過向脊髓注射這些誘導分化而來的神經(jīng)星形膠質(zhì)細胞，來替代ALS患者體內(nèi)病變的星形膠質(zhì)細胞，達到治療目的。從iPSCs分化而來的神經(jīng)小膠質(zhì)細胞（microglial）也在臨床試驗中用于治療ALS。

從 iPSCs誘導分化而來的多巴能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元、astrocytes、microglia和oligodendrocytes在大動物和臨床試驗中用于治療多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis）、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森綜合征脊髓損傷等神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病。從iPSCs誘導分化而來的視錐和視桿細胞在細胞替代療法中作為種子細胞治療黃斑性病變，患者視力得到明顯提高，表現(xiàn)出良好的療效。

最近的一系列研究表明，細胞替代療法不僅能夠在 AD、PD等神經(jīng)退行性疾病中替代病變的神經(jīng)元，幫助患者恢復正常的神經(jīng)元功能，而且能夠應用于瘋牛病等prion疾病的治療中。由 iPSCs分化而來的神經(jīng)干細胞（neuronal stem cells，NSCs）、神經(jīng)祖細胞（neuronal progenitor cells，NPCs）移植入 prion疾病動物模型中，神經(jīng)元的壽命和功能都得到了顯著的改善，提示細胞替代療法可以成為prion疾病治療的新方向。

3 細胞替代療法與基因編輯

對于很多遺傳疾病來說，自體干細胞攜帶基因突變，無法作為細胞替代療法的種子細胞。在理論上，基因編輯技術對遺傳疾病中突變的基因進行校正可以徹底治愈所有的遺傳疾病。基因校正有兩種途徑。一種是體內(nèi)途徑，即將基因編輯相關病毒或質(zhì)粒直接注射入患者體內(nèi)。這種策略的優(yōu)點是簡便易行、成本較低。早期的基因治療多數(shù)采用這種策略。這一策略的最大隱患是可能存在安全性問題。由于相關病毒或質(zhì)粒進入人體后的行為完全無法控制，可能進入錯誤的組織器官，可能發(fā)生錯誤的修改。這些副作用無法被預判，且目前也難以被控制，因而這種策略有比較大的安全隱患。此外，直接轉入體內(nèi)的病毒或質(zhì)粒等只能瞬時表達，持續(xù)時間較短，患者可能需要進行多次注射，這更進一步增加了安全隱患。引入人體的基因校正相關外源蛋白及病毒載體上存在的外源蛋白可能會在受體中引起強烈的免疫反應，造成嚴重的副作用。

離體基因校正（ex vivogene therapy）技術可以有效地解決體內(nèi)基因治療所存在的上述問題。離體基因校正是指首先從患者體內(nèi)分離細胞，在細胞中進行基因校正，鑒定正確之后，再將基因與功能均正常的細胞移植入患者體內(nèi)。由于干細胞具有自我更新和擴增能力，因此是進行離體基因校正的最佳選擇。離體基因校正是在干細胞和基因編輯技術的基礎上形成的交叉融合治療方法，其本質(zhì)是利用基因校正后的健康功能干細胞進行細胞替代治療。

由于導入體內(nèi)的是細胞，細胞在體外可以進行充分的質(zhì)控與質(zhì)檢，在體內(nèi)的行為也更容易被追蹤與控制，因而大大地提高了安全性。干細胞及其分化產(chǎn)生的下級細胞可以整合入體內(nèi)，因此基因編輯后的干細胞及其衍生細胞能夠在體內(nèi)長期存在，理論上采用經(jīng)過基因校正后的細胞進行細胞替代治療可以永久治愈遺傳疾病。此外，由于離體基因校正法中引入人體的是自體細胞，不涉及外源基因的表達，因而能夠大大減輕免疫排斥反應。雖然結合基因校正的細胞替代療法具有多種優(yōu)越性，但是也有成本高、耗時長的缺點。另外，這一方法的最大技術瓶頸在于很多成體干細胞在體外難以擴增和轉染/感染，因此建立干細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)、擴增和轉染/感染系統(tǒng)將極大地促進離體基因校正法在臨床的應用。

目前，在杜氏肌營養(yǎng)不良患者的iPSCs中進行基因校正后，將其移植入動物模型中表現(xiàn)出一定的療效。經(jīng)過基因校正的HSCs已經(jīng)在臨床試驗中用于白血病、鐮形細胞貧血、地中海貧血等疾病的治療，并表現(xiàn)出顯著的療效。

CAR-T療法是另一個基因修飾后進行細胞替代治療的例子。經(jīng)過基因修飾后的 T細胞移植入腫瘤病人體內(nèi)，替代患者體內(nèi)喪失功能的T細胞，達到殺傷腫瘤細胞的目的。基因治療與干細胞技術相結合，將進一步促進細胞替代療法的發(fā)展，為人類疾病的治療提供更多的路徑和方法。

4 細胞替代治療與免疫反應

細胞替代治療的種子細胞移植入患者體內(nèi)可能會引起受體的免疫排斥反應。特別是為了降低成本，多數(shù)治療策略傾向于使用統(tǒng)一來源的“標準”細胞系制備用于細胞替代治療的種子細胞，在移植后這些異體細胞會導致免疫排斥反應。有時移植導致的免疫反應非常強烈，甚至會危及患者生命。因而在多數(shù)細胞替代治療中需要給患者使用免疫抑制劑。長期使用免疫抑制劑，會產(chǎn)生一系列副作用。因此，制備低免疫原性的種子細胞是細胞替代治療研究中的重要方向。用自體細胞作為細胞替代療法的種子細胞是解決這一問題的另一個策略。但是，由于自體細胞高度個性化，因此如何降低成本是需要考慮的重要問題。

除了受體的免疫排斥之外，很多疾病都會導致體內(nèi)產(chǎn)生異常炎癥微環(huán)境，從而阻礙細胞替代療法中移植入的細胞在體內(nèi)的增殖和定植。例如，DMD患者體內(nèi)即存在異常的高炎癥因子，如 IFNγ、IL6等炎癥因子的表達水平都很高。移植入的肌肉干細胞在這些異常高水平的炎癥因子作用下，產(chǎn)生增殖和分化障礙。因此，改善患者體內(nèi)的微環(huán)境，增加細胞替代療法所移植的種子細胞在體內(nèi)的存活率，提高移植細胞的增殖、分化和定植能力，是細胞替代療法發(fā)展過程中所必須解決的問題。

5 結語

綜上所述，細胞替代療法是在細胞生物學和干細胞生物學研究成果基礎上發(fā)展起來的一種新的醫(yī)療方式。雖然目前多數(shù)細胞替代療法還處在臨床前和臨床研究階段，但是現(xiàn)有結果清楚地表明，這一治療方法的發(fā)展、成熟將為現(xiàn)有技術帶來革命性的變化。更多的深入研究和臨床試驗結果將幫助我們開發(fā)和鑒定更好的種子細胞，提高功能和安全性。與基因編輯等新技術的結合，將使我們獲得功能更完善、抗逆能力更強的細胞，以用于細胞替代治療。?

（摘自《中國細胞生物學學報》2019年第4期）