高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定糧油中黃曲霉毒素B1

□ 宋寒寒 黃 浩 山東中質(zhì)華檢測試檢驗有限公司

1 前言

黃曲霉毒素B1（AFB1）對人畜的健康危害極大，所以對它的監(jiān)控十分必要。目前食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中AFB1的測定方法依照GB 5009.22-2016，分別有同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、柱前衍生法、柱后衍生法、薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附篩查法。目前主要應(yīng)用的是液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。本課題以糧油為基質(zhì)研究AFB1的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，探究不同的條件對實驗結(jié)果的影響，旨在簡化前處理步驟、降低成本、提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Agilent Technologies液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜儀、湘儀高速冷凍離心機、北京普析純水機、上海精科實業(yè)有限公司渦旋振蕩器、Eppendorf單道微量移液器、美國Organomation氮吹儀、Waters固相萃取裝置。

北京康源泰博生物科技有限公司黃曲霉毒素B1免疫親和柱、BONNAAGELA TECHNOLOGIES Cleanert MC。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純；水為一級水；ANPEL AFB1外標(biāo)（濃度為1 mg/L，-10 ℃貯存）；Biopure AFB1同位素內(nèi)標(biāo)（濃度為0.5 μg/mL，-18 ～ -22 ℃貯存）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用乙腈將AFB1標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為20 μg/kg的使用液，轉(zhuǎn)移至棕色標(biāo)品試劑瓶中。用乙腈將AFB1內(nèi)標(biāo)配制成濃度為50 μg/kg的使用液，轉(zhuǎn)移至棕色標(biāo)品試劑瓶中。以上標(biāo)品使用液的貯存條件為-18 ℃避光。將0.1%甲酸水溶液與乙腈以1∶9的比例混合，配置成稀釋液，待用。AFB1使用液中加入稀釋液，配制成0.5、1、2、5、10、20 μg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中每個標(biāo)準(zhǔn)溶液都含有0.5 μg/kg的AFB1內(nèi)標(biāo)。

2.3 儀器條件與方法設(shè)置

2.3.1 色譜條件

流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈；梯度 A 相 為 90%（1～2 min），10%（2～5 min），90%（6～7 min）；流速0.4 mL/min；色譜柱為Agilent C18（2.1×50 mm、1.8μm、1200 bar）；柱溫40 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件

母離子的選擇：根據(jù)AFB1分子的化學(xué)電離性質(zhì)，結(jié)合儀器條件與流動相的選擇，離子化模式選為AJS ESI+。簡化掉色譜柱的保留作用，通過直接進(jìn)樣法，進(jìn)行母離子掃描。在一級全掃描狀態(tài)下得到準(zhǔn)分子離子，調(diào)節(jié)儀器碎裂電壓（Fragmentor）使母離子豐度達(dá)到最大，確定AFB1的母離子質(zhì)量數(shù)。

子離子的選擇與優(yōu)化：進(jìn)一步進(jìn)行子離子掃描，采集碎片離子信息，選擇豐度較大、靈敏度較好且干擾較小的兩對碎片離子作為定性子離子和定量子離子，并對子離子進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置一個合適的碰撞能量區(qū)間（可多次調(diào)整），其中能產(chǎn)生最高豐度子離子的數(shù)值即為最優(yōu)電壓，以達(dá)到最佳靈敏度。

2.4 樣品前處理

2.4.1 提取

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入相應(yīng)標(biāo)品使用液渦旋振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL甲酸-水-乙腈溶液（比例為0.1∶15.9∶84），渦旋混勻，在9 000 r/min下離心5 min，取上清液備用。

2.4.2 凈化

準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入46 mL 1%吐溫-20的PBS，混勻。將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待原有液體流盡，將樣液移至免疫親和柱上方的注射器筒中，調(diào)節(jié)至以1 mL/min的速度穩(wěn)定下滴。樣液過濾完后，再加入2×10 mL水淋洗、抽干。在親和柱下方放置10 mL刻度試管，加入2×2 mL甲醇洗脫，控制1 mL/min的速度下滴。收集全部洗脫液，50 ℃下氮氣吹干，加1.0 mL初始流動相定容，0.2 μm有機濾膜過濾，待進(jìn)樣。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)化

溶液經(jīng)由電噴霧霧化，形成微小霧滴，進(jìn)而電離。因此溶液的成分對AFB1的離子化效率有所影響。本實驗對不同成分的流動相進(jìn)行對比，結(jié)果顯示當(dāng)乙腈中加入適量的甲酸，創(chuàng)造出酸性環(huán)境，離子化效率較高，并且峰形較好、AFB1響應(yīng)較高（見圖1至圖5）。因此，本實驗選擇0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液與乙腈作為流動相。

圖1 AFB1色譜圖

圖2 AFB1色譜圖（含有甲酸）

圖3 AFB1豐度比

圖4 AFB1豐度比（含有甲酸）

3.2 提取液的優(yōu)化

AFB1是極性較強的化合物，對于固態(tài)樣品，可在研磨后直接使用提取液提取；對于液態(tài)樣品，多為油脂類化合物，可采用萃取的方法提取。本實驗使用不同的提取液多次重復(fù)試驗，對樣品的加標(biāo)回收率對比，結(jié)果表明以甲酸-水-乙腈溶液（0.1∶15.9∶84）作為提取液時，回收率最高（見表1）。

表1 不同提取液對應(yīng)的AFB1回收率

圖5 AFB1質(zhì)譜圖

3.3 提取次數(shù)的優(yōu)化

基質(zhì)與提取液中的AFB1濃度總是存在一定的平衡關(guān)系，隨著提取次數(shù)的增加，基質(zhì)中的AFB1會被更充分的提取出來。通過提取1次、2次、3次、4次、5次的回收率對比，2次提取能明顯的提高回收率，但是再繼續(xù)提取，并沒有相對等量的效果提升。結(jié)合時間、資源成本等考慮，以2次提取為最佳。

3.4 凈化方式的優(yōu)化

本實驗對比了免疫親和柱和Cleanert MC兩種凈化方法。免疫親和柱是利用抗原抗體反應(yīng)原理來進(jìn)行化合物的篩選，針對性強，不能同時檢測多種真菌毒素。Cleanert MC通用性強，使用方法簡單，對應(yīng)的實驗室設(shè)備非常少。并且無需活化、洗脫、氮吹等步驟，一步過濾實現(xiàn)凈化。兩種方法均能達(dá)到85%～100%的回收率，結(jié)合操作方法、成本考慮，使用Cleanert MC更佳。

3.5 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)化

本實驗同時采用了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法進(jìn)行分析。在提取基質(zhì)AFB1的過程中，經(jīng)過容器、耗材的吸附以及部分溶液殘留，AFB1的微量損失是不可避免的，內(nèi)標(biāo)法就是利用內(nèi)、外標(biāo)化合物的等比例損失，來消除這種誤差。相比而言，外標(biāo)法就與前處理及凈化過程有關(guān)，操作步驟越簡單、凈化效率越高，則外標(biāo)法回收率越高。通過加標(biāo)回收試驗對比，內(nèi)標(biāo)法的結(jié)果更加準(zhǔn)確，外標(biāo)法成本低、對環(huán)境的污染比較小。

4 結(jié)論

本文建立了糧油中的AFB1的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法前處理步驟簡單、條件易于控制、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、成本低廉，能夠滿足各個地區(qū)對AFB1檢測的要求，適用于日常糧油中AFB1的檢測。