雞蛋磺胺間甲氧嘧啶殘留研究

夏 魏，李祖光，楊 華，吉小鳳，汪建妹，錢鳴蓉，*

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine， SMM)是磺胺類(sulfonamides， SAs)抗菌藥之一，具有抗菌和預(yù)防細(xì)菌感染的作用，常用于畜牧業(yè)、獸醫(yī)臨床預(yù)防，以及細(xì)菌性疾病控制，以提高動物抗病力和改善生產(chǎn)性能[1-2]。然而該類藥物的超劑量使用或濫用會使藥物殘留期延長，人類食用此類動物源性產(chǎn)品后，可能會增強對該類抗菌藥物的耐藥性，對人體健康有潛在危害[3-4]。

藥物在動物體內(nèi)一般經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄4個過程，不同生物的殘留消除規(guī)律有所不同[5]。目前，磺胺類藥物在豬、猴、兔、魚等動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究均有報道[6-7]，但雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留消除規(guī)律的相關(guān)研究較少，僅在測定方法方面有部分報道。為保障雞蛋質(zhì)量安全，維護消費者利益，本研究采用蛋雞投藥模擬試驗，收集停藥后一段時間內(nèi)的雞蛋，測定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶藥物殘留量，以期探析磺胺間甲氧嘧啶殘留在雞蛋中的消除規(guī)律，并給出相應(yīng)的休藥期建議，為實際生產(chǎn)過程中保障雞蛋產(chǎn)品質(zhì)量安全提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

30%磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉，浙江杭州愛力邁；色譜純乙腈和甲醇，德國Merck公司；無水乙酸鈉(純度99.0%)，溫州市化學(xué)用料廠；無水硫酸鈉(純度98.0%)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(純度99.5%)，廣東光華科技股份有限公司；甲酸(純度99.0%)，美國ACS恩科化學(xué)。試驗用水為Milli-Q系統(tǒng)純化水?；前烽g甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取適量藥物，用甲醇溶解，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

QTRAP 6500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，美國AB SCIEX公司；T25勻漿機，德國IKA公司；EOFO-945616渦旋儀，美國Talboys公司；Biofuge Primo R離心機，德國Thermo Fisher公司。

1.2 飼養(yǎng)管理及給藥方法

選取32周齡、體質(zhì)量1.6 kg的籠養(yǎng)蛋雞(品種為海蘭白)開展試驗。對照組(20只蛋雞)自由采食和飲水(無藥物添加)；試驗組分為高劑量組(30只蛋雞)和低劑量組(30只蛋雞)，分別以標(biāo)簽推薦最高劑量及其1/2劑量開展試驗，藥物濃度分別為159 mg·L-1和79.5 mg·L-1，添加至蛋雞飲水中。試驗組蛋雞自由采食和飲水(有藥物添加)，連續(xù)喂藥5 d后停藥。休藥期每天于同一時間點收集雞蛋，并測定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的殘留量，取樣時間持續(xù)至雞蛋中無藥物殘留檢出。

1.3 采樣及樣品處理

停藥期間，每天同一時間點收集所產(chǎn)雞蛋，每個取樣點各劑量組隨機選取5個雞蛋混勻為一個樣品，制備5個重復(fù)，樣品于-20 ℃冰箱冷凍保存。

稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈(含體積分?jǐn)?shù)1%乙酸)，渦旋1 min，超聲15 min，8 000 r·min-1離心3 min。上清液轉(zhuǎn)移至裝有0.5 g無水乙酸鈉和2.0 g無水硫酸鎂的50 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r·min-1離心3 min，取1.5 mL上清液于裝有100 mg C18和150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心3 min，取0.5 mL上清液至裝有0.5 mL去離子水的2 mL離心管中，混勻后，過0.20 μm微孔濾膜，進UPLC-MS/MS分析測定。

1.4 測定方法

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，樣品溫度25 ℃，進樣體積5 μL，流速0.2 mL·min-1，流動相為0.1%甲酸溶液+2 mmol·L-1甲酸銨水溶液(A)和甲醇(B)，具體洗脫程序見表1。

表1液相色譜梯度洗脫程序

Table1Gradient elution program of liquid chromatography

t/min流速Flow rate/(mL·min-1)流動相A、B體積比Volume ratio of mobile phase A to B00.295∶50.50.295∶51.00.275∶253.00.275∶2511.00.220∶8012.00.20∶10013.00.20∶10013.10.295∶515.00.295∶5

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，多反應(yīng)檢測(MRM)模式，氣簾氣和碰撞氣均為氮氣，離子噴霧電壓5 500 V，離子源溫度450 ℃，霧化溫度300 ℃。以一級全掃描質(zhì)譜圖中磺胺間甲氧嘧啶的準(zhǔn)分子離子作為各自的母離子，對其進行碰撞誘導(dǎo)解離，以峰度較強的二級碎片離子作為各自的定量離子，以上述離子反應(yīng)進行定量分析，具有較高的專屬性。具體地：定量離子對281.2/156.1，碰撞能量26 eV，去簇電壓87 eV，保留時間6.66 min；定性離子對281.2/108.1，碰撞能量38 eV，去簇電壓87 eV，保留時間6.66 min。

1.5 方法驗證

本試驗采用外標(biāo)法定量，配置系列磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.1、1.0、5.0、20、100 μg·L-1，每個濃度重復(fù)3次，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以3倍信噪比計算的值作為檢出限，以10倍信噪比計算的值作為定量限。在分析實際樣品前，對其進行3個濃度水平(20、50、100 μg·kg-1)的加標(biāo)回收試驗，每個添加水平重復(fù)測試5次。

1.6 雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留在休藥后的降解動力學(xué)分析

對休藥后雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留量做一級反應(yīng)動力學(xué)分析。試驗數(shù)據(jù)用下式擬合：

Ct=C0e-kt，

(1)

(2)

式(1)、(2)中：Ct為t時測得雞蛋樣品中的藥物濃度，C0為喂藥期結(jié)束時(第1天)雞蛋樣品中該藥物的濃度，k為消除速率常數(shù)，t1/2為凈化半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制系列磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定好的儀器條件下進行測定，樣品色譜圖如圖1所示。根據(jù)保留時間對應(yīng)的峰面積(y)與其濃度(x)進行線性回歸，磺胺間甲氧嘧啶在0.1～100 μg·L-1線性良好，回歸方程為y=88 924x+42 202，決定系數(shù)R2=0.999 7(圖2)。

2.1.2 檢測限、定量限和回收率

經(jīng)測算，本文檢測方法的檢出限為0.03 μg·kg-1，定量限為0.1 μg·kg-1，試驗條件下磺胺間甲氧嘧啶的回收率為80.9%～101.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～11.5%，方法穩(wěn)定可靠。

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)

圖1 雞蛋樣品中磺胺間甲氧嘧啶的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of sulfamonomethoxine in egg sample

圖2 UPLC-MS/MS測定磺胺間甲氧嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of sulfamonomethoxine detected by UPLC-MS/MS

雞蛋富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)等，對目標(biāo)物的測定可能會產(chǎn)生一定影響。為了解雞蛋樣品基質(zhì)對磺胺間甲氧嘧啶殘留定量測定的影響，對基質(zhì)效應(yīng)進行評價。首先，選擇未檢出的陰性樣品按照1.3節(jié)方法進行凈化處理后，在基質(zhì)液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.1、1.0、10、20、50、100 μg·L-1，然后對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，得到回歸方程y=95 957x+42 371，R2=0.999 5。將該斜率值與同系列標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸曲線方程的斜率值進行比較，兩者的比值為0.93，說明通過前處理方法獲得的樣品中基質(zhì)效應(yīng)較小，可采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進行定量分析。

2.2 休藥后雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留變化

對照組雞蛋樣品中無殘留檢出。如表2所示，隨著休藥時間延長，雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留量逐漸降低，直至低于檢測限，高劑量組的雞蛋中藥物殘留消除時間明顯長于低劑量組。高劑量組在休藥后第1、3、5、10、16、20、24天，磺胺間甲氧嘧啶殘留量分別為2 497.3、220.1、38.9、6.0、1.3、0.5、0.1 μg·kg-1；低劑量組在休藥后第1、3、5、10、16天，磺胺間甲氧嘧啶殘留量分別為694.3、45.2、15.5、1.5、0.1 μg·kg-1。參照原農(nóng)業(yè)部2002年第235號公告，禽肉中磺胺間甲氧嘧啶最大殘留限量為100 μg·kg-1，則高劑量組在休藥后第5天、低劑量組在休藥后第3天，雞蛋中的磺胺間甲氧嘧啶殘留量即低于此規(guī)定，綜合來看，休藥期建議在5 d以上。若參照方法檢測限，要獲得磺胺間甲氧嘧啶殘留無檢出的雞蛋，休藥期建議在25 d以上。

表2休藥后雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的殘留量(n=5)

Table2Residue of SMM in egg without sulfamonomethoxine injection(n=5)

休藥后時間Withdrawalperiod/d磺胺間甲氧嘧啶殘留量SMM residue content/(μg·kg-1)高劑量組High-dose group低劑量組Low-dose group12497.3±440.78694.3±137.742341.5±57.50124.1±13.043220.1±40.8145.2±7.874100.5±16.5426.1±4.78538.9±6.9215.5±2.75624.6±4.6110.7±2.12712.1±1.906.1±0.6888.9±1.133.1±0.5697.3±1.062.0±0.39106.0±1.101.5±0.17114.5±0.740.9±0.14132.6±0.510.7±0.10161.3±0.220.1±0.02181.0±0.17—200.5±0.09—220.4±0.06—240.1±0.01—26——

2.3 雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留的消除規(guī)律

高劑量組，磺胺間甲氧嘧啶在前4 d消除較快，殘留量下降了98%以上；低劑量組，磺胺間甲氧嘧啶在前2 d消除較快，殘留量下降了97%以上。經(jīng)測算：高劑量組的消除速率常數(shù)(k)為0.4 μg·kg-1·d-1，t1/2為1.9 d；低劑量組的消除速率常數(shù)(k)為0.6 μg·kg-1·d-1，t1/2為1.2 d。在不同的給藥劑量下，雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的消除速率常數(shù)和半衰期不同，這可能是由于不同劑量的磺胺間甲氧嘧啶對動物體肝藥酶系統(tǒng)活性產(chǎn)生了影響，或者可能是因為不同劑量的磺胺間甲氧嘧啶在雞蛋中的藥動學(xué)行為呈某種線性關(guān)系，如劉曉暉等[8]在大鼠體內(nèi)進行不同劑量紅景天苷的研究中發(fā)現(xiàn)，劑量與藥動學(xué)行為有線性關(guān)系。相關(guān)原因還須進一步分析確認(rèn)。

3 討論

本研究利用QuEChERS方法進行前處理，建立了UPLC-MS/MS測定雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留的檢測方法。該方法操作簡單，提取效果和穩(wěn)定性良好，適用于大批量樣品的檢測分析，可為雞蛋中磺胺類藥物的殘留風(fēng)險評估提供方法借鑒。利用該方法通過蛋雞投藥模擬試驗對雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶殘留消除規(guī)律進行研究，結(jié)果表明，高劑量投藥組雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的半衰期長于低劑量組，低劑量投藥組雞蛋磺胺間甲氧嘧啶的消除速率快于高劑量組。為確保雞蛋產(chǎn)品的質(zhì)量安全：若參照原農(nóng)業(yè)部相關(guān)規(guī)定，本試驗劑量下的安全休藥期建議為5 d以上；若參照本試驗方法最低檢測限，建議休藥期在25 d以上。

目前，QuEChERS[11]方法已廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品的前處理中。Wen等[12]在5.0 g樣品中加入15 mL含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈溶液，結(jié)合分散固相萃取(dSPE)對多種動物組織(牛肉、豬肉、雞肉、牛肚和豬肝)中磺胺類藥物進行提取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定，取得了良好的結(jié)果，樣品回收率為74.0%～100.3%，檢測限為0.01～12.5 μg·kg-1，精確度為0.4%～10.5%。該方法可應(yīng)用于脂肪含量較高的生物樣品，但還未在雞蛋樣品中進行過驗證。Huertas-Pérez等[13]采用QuEChERS前處理方法對雞肉和雞蛋中多種抗生素類藥物進行提取，稱取5.0 g樣品加入5 mL水和10 mL含有1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈溶液，離心后取3 mL液體至Z-Sep凈化管中，氮吹定容，以液相色譜法(HPLC)測定，回收率為65.0%～88.1%，定量限為14～85 μg·kg-1。本研究在QuEChERS方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了稱樣量，采用通用的凈化材料，建立了適用于雞蛋中磺胺間甲氧嘧啶的測定方法。與上述2種方法相比，本試驗方法的回收率更高，靈敏度更高。這主要是因為本試驗操作步驟少，減少了提取凈化過程中的損失，且使用的UPLC-MS/MS儀器靈敏度高。