透明質(zhì)酸鋅的合成及在小鼠創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用

張海娟，章琪露，徐穎，徐莉菲，金柳君，許可

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州大學(xué) 生命科學(xué)研究院，浙江 溫州 325035）

皮膚損傷是臨床上的常見病與多發(fā)病，而透明質(zhì)酸在體內(nèi)主要發(fā)揮維持細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境以及細(xì)胞修復(fù)等功能[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸具有良好的生物相容性以及在創(chuàng)面愈合中的生物活性等，逐漸應(yīng)用于創(chuàng)面敷料或組織工程等領(lǐng)域[2]。鋅劑具有較強(qiáng)的皮膚收斂和殺菌作用，因此將透明質(zhì)酸與鋅結(jié)合[3]，但目前國內(nèi)并無相關(guān)品牌，且我國相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。本研究對透明質(zhì)酸鋅制備工藝進(jìn)行相關(guān)改進(jìn)，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定，對其創(chuàng)面愈合效果進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料 取SPF小鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±5）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。透明質(zhì)酸鈉購于山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，氯化鋅購于汕頭西隴科學(xué)有限公司，氯化鈉購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，胰化蛋白胨及酵母提取物均購于英國OXOID公司。鈉離子儀購于杭州齊威儀器有限公司，原子吸收光譜儀購于美國Thermo公司。

1.2 透明質(zhì)酸鋅合成方法 稱取0.15 mol/L氯化鋅溶液，靜置0.5 h后取上清（約為0.1 mol/L），然后逐滴加到透明質(zhì)酸鈉溶液中（0.25 g溶于25 mL蒸餾水）；同時(shí)用鈉離子儀檢測溶液鈉離子濃度，記錄數(shù)據(jù)：當(dāng)儀器數(shù)值穩(wěn)定后，補(bǔ)蒸餾水到50 mL，得到0.5%透明質(zhì)酸鋅溶液。

1.3 原子吸收法檢測金屬元素含量 將透明質(zhì)酸鈉和氯化鋅溶液反應(yīng)過夜后，3 000目透析袋透析1周，期間每隔12 h換一次水，然后取出放置在-80 ℃ 冷凍過夜，再放入真空干燥機(jī)24 h以上，待完全凍干后取出。稱取凍干后的透明質(zhì)酸鋅稀釋成一定濃度溶液，然后用原子吸收光譜儀檢測溶液中鈉元素和鋅元素的含量。

1.4 透明質(zhì)酸鋅抗菌性能檢測 將大腸桿菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 h后，分別配制0.5%透明質(zhì)酸鈉溶液，0.5%透明質(zhì)酸鋅溶液，以及pH 5.5的枸櫞酸溶液（對照組），取一定量大腸桿菌溶液，加入到上述溶液中混合培養(yǎng)1～3 h，然后取上述混合液100 μL到LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出計(jì)算菌落數(shù)。

1.5 動(dòng)物創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn) 取10只健康小白鼠，雌雄各半，制備小鼠全層皮膚切除模型，利用八針法將墊圈縫在老鼠背部兩側(cè)，傷口對稱，然后分別涂上透明質(zhì)酸鋅溶液（0.5%）和透明質(zhì)酸鈉溶液（0.5%），待液體干了之后用繃帶將傷口包上，傷口每天涂抹2次，每隔數(shù)天拍照記錄創(chuàng)面面積。見圖1。

圖1 小鼠全層皮膚切除模型

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透明質(zhì)酸鋅的合成 利用鈉離子檢測儀檢測溶液中鈉離子濃度，當(dāng)鈉離子濃度儀數(shù)值不再變化時(shí)，停止添加氯化鋅溶液。隨著氯化鋅含量逐漸升高，儀器數(shù)值逐漸升高，當(dāng)添加量約為6.25 mL，反應(yīng)達(dá)到平衡（見圖2）。若透明質(zhì)酸鈉完全解離，計(jì)算可得反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)氯化鋅添加的理論值應(yīng)為6.00 mL， 排除實(shí)驗(yàn)誤差，理論值和實(shí)際值接近。

圖2 氯化鋅添加量與鈉離子濃度的關(guān)系

2.2 透明質(zhì)酸鋅性質(zhì)鑒定 本研究將生產(chǎn)的透明質(zhì)酸鋅溶液進(jìn)行透析和凍干，然后利用元素分析檢測所 含鋅離子和鈉離子含量。經(jīng)稀釋后透明質(zhì)酸鈉中鈉離子濃度為0.269 mg/L，鋅離子濃度為0.004 mg/mL， 而透明質(zhì)酸鋅中鈉離子濃度為0.290 mg/mL，鋅離子濃度為0.024 mg/mL。透明質(zhì)酸鈉轉(zhuǎn)化為透明質(zhì)酸鋅過程中，1個(gè)鋅離子取代2個(gè)鈉離子，鈉離子分子量為23，鋅離子分子量為65.5；根據(jù)元素分析儀所測結(jié)果及物質(zhì)的量換算表明取代下來的鈉離子與結(jié)合上去的鋅離子摩爾比為2:0.9；排除實(shí)驗(yàn)誤差，接近理論值的2比1。見圖3。

圖3 干燥后透明質(zhì)酸鋅粉末

2.3 透明質(zhì)酸鋅抑菌實(shí)驗(yàn) 有研究敘述了透明質(zhì)酸鋅具備抗菌性能[4]，但是未做深入研究。本研究透 明質(zhì)酸鋅溶液pH值為5.3左右，因此需要設(shè)相同的pH組來驗(yàn)證抑菌效果。由于起始細(xì)菌數(shù)過高，透明質(zhì) 酸鈉溶液組（pH 6.8）和對照組（pH 5.5）未表現(xiàn)出明 顯差距（1 cm×1 cm）；與透明質(zhì)酸鈉溶液和緩沖溶液相比，透明質(zhì)酸鋅溶液抑菌效果更好，見圖4和5。2.4 透明質(zhì)酸鋅促創(chuàng)面修復(fù) 透明質(zhì)酸鋅的促愈合效果好于透明質(zhì)酸鈉。在第12天和第15天2組創(chuàng)面面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6-7。

圖4 不同溶液的抑菌效果

圖5 不同溶液對應(yīng)細(xì)菌菌落數(shù)比較

3 討論

創(chuàng)面是正常皮膚或組織在外界致傷因子以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)還有可能使皮膚的正常功能受 損[5]。創(chuàng)面損傷愈合包括血液凝固、炎癥反應(yīng)、血管發(fā)生、纖維組織形成、上皮化、創(chuàng)面收縮、塑形，是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜而精細(xì)的生物學(xué)過程[6]。當(dāng)多種因素造成皮膚愈合不良、形成瘢痕時(shí)，不僅影響患者的美觀，還可導(dǎo)致患者肢體功能障礙，甚至危及生命。研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面愈合過程中，細(xì)胞外基質(zhì)起到重要作用，它可以為細(xì)胞提供移動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)和向?qū)?，把?xì)胞黏附在一起，對組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長因子生物活性及其調(diào)節(jié)作用[7]。膠原蛋白與透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白在修復(fù)上的臨床應(yīng)用已經(jīng)較為普遍，不少研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸因在無瘢痕愈合方面有明顯作用而受到人們越來越廣泛的關(guān)注[8]。 透明質(zhì)酸及其鹽是廣泛存在于人體內(nèi)的生理活性物質(zhì)，由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位連接而成的一種高分子黏多糖。其中透明質(zhì)酸鈉臨床應(yīng)用較多[9]，在皮膚損傷實(shí)驗(yàn)中抗感染是至關(guān)重要的一環(huán)，但透明質(zhì)酸鈉在此方面較為欠缺。鋅被稱為“生命元素”，它是所有生物系統(tǒng)必需的微量元素，也是人體必需的14種微量元素之一[10]。研究發(fā)現(xiàn)，改善全身或創(chuàng)面局部鋅營養(yǎng)狀態(tài)可促進(jìn)不同類型的創(chuàng)面修復(fù)[11]，此外鋅劑具有較強(qiáng)的皮膚收斂和殺菌作用，對外科手術(shù)及創(chuàng)面感染有一定的療效，不少研究也發(fā)現(xiàn)鋅是一種安全性很好的抗菌金屬物質(zhì)[12]。臨床用藥爐甘石其有效成分就是碳酸鋅和氧化鋅，其作用是保護(hù)和收斂皮膚[13]。鋅離子還可以作為透明質(zhì)酸鈉的陽離子替代物增加治療效果，透明質(zhì)酸鋅已經(jīng)被證實(shí)是一種新型復(fù)合物[14]， 因此將透明質(zhì)酸與鋅結(jié)合，能更好地發(fā)揮協(xié)同促創(chuàng)面愈合的作用。但透明質(zhì)酸鋅目前國內(nèi)沒有相關(guān)產(chǎn)品、原料等，我國市場主要是被匈牙利吉瑞大藥廠所生產(chǎn)的愈膚欣醫(yī)用透明質(zhì)酸鋅凝膠占據(jù)，并且我國相關(guān)基礎(chǔ)研究還較少[15]。BURGER等[4]發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸鈉不完全解離，但在鋅離子作用下，原來與透明質(zhì)酸鹽鍵合的鈉離子能釋出，并且隨著鋅離子濃度增加，鈉離子釋出也增多，當(dāng)?shù)犬?dāng)量的鋅離子與透明質(zhì)酸鈉反應(yīng)時(shí)，鈉離子就能完全釋出。本研究通過測得透明質(zhì)酸鈉與氯化鋅反應(yīng)后鈉離子濃度的趨勢變化并計(jì)算出完全反應(yīng)氯化鋅的理論添加值6.00 mL與實(shí)際值6.25 mL接近（見圖2），證明透明質(zhì)酸鈉完全電離，且該反應(yīng)為完全反應(yīng)。匈牙利專利[16]報(bào)道了粉末狀透明質(zhì)酸鋅的制備工藝：將透明質(zhì)酸鈉溶于水，加入鋅鹽后用有機(jī)溶劑沉淀，再用有機(jī)溶劑脫水干燥。此法簡單快速，但是鹽離子較多。目前國內(nèi)外采用的是離子交換樹脂法，占用設(shè)備多，操作較復(fù)雜，價(jià)格昂貴，因此限制了透明質(zhì)酸鋅的臨床應(yīng)用[17-18]。有研究報(bào)道說透明質(zhì)酸與鋅更多的是通過共價(jià)鍵形式連接[19]，本研究也對透明質(zhì)酸鋅該性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，這提示我們可以通過控制氯化鋅的添加量，使反應(yīng)雜質(zhì)達(dá)到最低，而透析則利用相對分子質(zhì)量大小差異將透明質(zhì)酸鋅與雜質(zhì)進(jìn)行分離。參考該報(bào)道并針對兩者工藝的缺陷，本研究通過改進(jìn)傳統(tǒng)的離子交換法，運(yùn)用透析的方法，去除生成的氯化鈉等小分子，制備出純度較高的透明質(zhì)酸鋅，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測透明質(zhì)酸與鋅是以共價(jià)鍵的形式連接，并且在抑菌實(shí)驗(yàn)中可見透明質(zhì)酸鋅的抑菌能力明顯強(qiáng)于透明質(zhì)酸鈉。本研究通過小鼠全皮切除創(chuàng)面實(shí)驗(yàn)來比較透明質(zhì)酸鈉和透明質(zhì)酸鋅促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果，結(jié)果表明透明質(zhì)酸鋅組的小鼠傷口愈合比透明質(zhì)酸鈉組更快，證明透明質(zhì)酸鋅具有協(xié)調(diào)促修復(fù)作用。但本實(shí)驗(yàn)還缺乏對透明質(zhì)酸鋅促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制研究，如是否對于血管損傷有影響或是否在促進(jìn)某種蛋白質(zhì)的增加等，因此接下來我們將重點(diǎn)研究其分子機(jī)制。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面連續(xù)愈合情況

圖7 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積大小