Th22細胞及IL-22因子在原發(fā)性肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達及意義

施振靜，吳道義，吳麗麗，喬彬彬，鄭冰汝，李成，施昌盛，虞希祥

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 介入科，浙江 溫州 325200；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325200；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 放化療科，浙江 溫州 325200；4.寧陵縣人民醫(yī)院 腫瘤科，河南 商丘 310006；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 介入科，浙江 溫州 325015；6.溫州市人民醫(yī)院 血管介入科，浙江 溫州 325699）

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤，我國80%～90%的肝癌由乙型肝炎引起，長期慢性炎癥反應(yīng)引起的惡變及免疫監(jiān)視逃逸是肝癌形成的重要原因[1]。肝炎、肝硬化的炎癥微環(huán)境是引發(fā)肝細胞惡性表型的重要因素[2]。具有免疫監(jiān)視作用的輔助性T細胞（T helper cell，Th cell）參與肝癌免疫逃逸并與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。此外，Th細胞分泌的細胞因子也是炎癥反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子[5]。本研究旨在研究肝癌患者中的Th細胞和IL-22水平及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2016年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診并經(jīng)臨床病理檢查確診為肝細胞肝癌伴慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化患者（肝癌組）38例，其中男26例，女12例；年齡39～61（60.6±16.8）歲。同時收集同一時期于我院就診經(jīng)臨床病理檢查確診為慢性乙型肝炎肝硬化患者42例（肝硬化組），其中男22例，女18例，年齡38～56（48.2±14.8）歲，均符合慢性乙型肝炎肝硬化診斷標準，就診前無抗病毒治療史。選取我院體檢中心同一時期的健康受檢者30例（健康對照組），其中男18例，女12例，年齡36～61（45.97±11.65）歲。選取于我院門診同一時期就診的慢性乙肝患者（慢性乙肝組）21例，其中男12例，女9例，年齡33～59（47.2±19.4）歲。4組受檢者排除標準：合并HIV、HCV或HDV感染；伴有其他惡性腫瘤或嚴重疾?。恍锞?、吸毒患者。4組性別和年齡均具有可比性。收集本院檢驗科所檢測4組受檢者臨床相關(guān)指標，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和白蛋白（albumin，ALB）信息。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有受檢者均知情同意。

1.2 主要試劑 人IL-22 ELISA試劑盒購自上海蘇賢生物科技有限公司，人淋巴細胞分離液購自觸凱生物科技（上海）有限公司，PBS液購自美國Hyclone公司，離子霉素、莫能霉素、TMB、固定劑和破膜劑購自美國Sigma公司，F(xiàn)ITC標記鼠抗人CD4單抗、PE標記鼠抗人IL-22購自上海旦震生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血液收集處理：所有受檢者于清晨空腹（住院患者為治療前）肘靜脈采血10 mL并用肝素抗凝管收集為2份，每份5 mL。一份標本在采集后的1～2 h以2 000 r/min離心15 min，分離血清，冷凍保存用于ELISA檢測。另一份用于分離及培養(yǎng)外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.3.2 ELISA檢測IL-22表達水平：將人抗IL-22抗體覆蓋在96孔板上，注入標準品或血清樣本到孔中，使樣品中的IL-22與固定抗體結(jié)合。洗滌液清洗96孔板后添加生物素標記的人抗IL-22抗體孵育。洗滌液清洗未結(jié)合的生物素抗體，并在孔中加入過氧化物酶共軛鏈霉親和素孵育。再次清洗96孔板，加入TMB底物溶液，每孔顯色的深淺與所結(jié)合的IL-22的數(shù)量成劑量關(guān)系。在450 nm處檢測吸光度值，根據(jù)標準曲線測定IL-22濃度。

1.3.3 分離及培養(yǎng)PBMC：取外周血去血漿，用淋巴分離液分離出人PBMC層，分離出的液體可形成4層。小心取出中間白膜層，即為PBMC層，然后將PBMC接種到培養(yǎng)板里孵育4 h。

1.3.4 流式細胞儀檢測：將孵育好的PBMC培養(yǎng)板內(nèi)的細胞用PBS洗滌沉淀制成106/mL的細胞懸液，分別移至流式管中，每管放置2×105個細胞，分別加入4 μL CD4-PerCP、固定劑和破膜劑，再分別加入1 μL IL-22-PE室溫孵育30 min，將染色后的細胞群上機檢測，并用Flowjo 7.6.1軟件分析各細胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床指標檢測結(jié)果 4組受檢者AST、ALT、TBIL和ALB差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中肝硬化組和肝癌組患者AST、ALT、TBIL和ALB顯著高于慢性乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；肝癌組患者AST、ALT、TBIL和ALB高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；慢性乙肝組和健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展患者的AST、ALT、TBIL和ALB逐漸升高。見表1。

2.2 流式細胞儀檢測結(jié)果 健康對照組、慢性乙肝組、肝硬化組及肝癌組外周血Th22細胞含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中肝癌組及肝硬化組的外周血Th22高于慢性乙肝組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肝癌組外周血Th22高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。慢性乙肝組的Th22細胞含量與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。此外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展，外周血Th22細胞含量逐漸升高。

表1 健康對照組、慢性乙型肝炎肝硬化患者和肝癌患者肝功能指標（±s）

表1 健康對照組、慢性乙型肝炎肝硬化患者和肝癌患者肝功能指標（±s）

與健康對照組比：aP＜0.05；與慢性乙肝組比：bP＜0.05；與肝硬化組比：cP＜0.05

組別 n ALT/（U/L） AST/（U/L） TBIL（μmol/L） ALB/（g/L）健康對照組 30 24.33±11.32 18.76±14.67 11.64± 6.82 41.57±25.64慢性乙肝組 21 37.29±19.87 29.11±21.46 15.31±10.58 50.33±32.86肝硬化組 42 109.12±75.81ab 83.56±51.42ab 29.34±13.45ab 67.64±48.61ab肝癌組 30 265.48±91.56abc 195.21±86.45abc 55.17±28.46abc 89.56±63.41abc

圖1 4組受檢者外周血Th22細胞含量的比較

2.3 ELISA法檢測結(jié)果 4組受檢者外周血IL-22表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中肝癌組及肝硬化組的外周血IL-22表達水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肝癌組外周血IL-22表達水平高于肝硬化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。慢性乙肝組的IL-22表達水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。此外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展，外周血IL-22水平逐漸升高。

2.4 肝癌組Th22含量和IL-22水平組內(nèi)分析 根據(jù)巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）分期[6]將本研究中納入的38例肝癌患者分為早期（n=11）和中晚期（n=27），并對血清中Th22含量和IL-22表達水平進行比較。結(jié)果顯示，早期肝癌患者外周血Th22含量和IL-22表水平低于中晚期肝癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 4組受檢者外周血IL-22表達水平的比較

3 討論

圖3 不同BCLC分期肝細胞肝癌患者外周血Th22細胞含量（A）和IL-22表達水平（B）的比較

Th細胞是T細胞的一種，其主要表面分子標記是CD4，激活后可分泌多種細胞因子以協(xié)助或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，目前發(fā)現(xiàn)Th細胞至少存在4種亞型，分別為Th1、Th2、Th17和Th22。Th1細胞主要分泌INF-γ、TNF-β、IL-2等細胞因子并參與細胞免疫，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起到重要的作用；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子并參與體液免疫，具有抗Th1細胞的作用[3]。生理狀態(tài)下，Th1/Th2比例處于平衡狀態(tài)；而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，存在著Th1/Th2漂移現(xiàn)象，Th1的相對減少可使機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視功能削弱[7-9]。Th17主要分泌IL-17、IL-4、IL-22和TNF-α等細胞因子，其在胃癌、急性白血病、卵巢癌等多種腫瘤中明顯增高，目前已有針對Th17細胞分化的調(diào)控分子的諸多報道[10-12]。 Th22細胞是發(fā)現(xiàn)于2009年的Th細胞亞群，因其主要分泌IL-22而得名，人體約65%的IL-22由Th22細胞分泌[13]。Th22細胞表面標志為CD4+，CCR6、CCR4和CCR10，除分泌IL-22外，還可分泌IL-10、IL-6、IL-13等多種細胞因子，但不產(chǎn)生IFN-γ、IL-4和IL-17[13]。Th22細胞主要通過IL-22發(fā)揮作用，IL-22的靶細胞為皮膚、胰腺、肝臟等組織細胞，在感染免疫、組織修復(fù)等方面起到重要作用[14]。在生理狀態(tài)下，Th22細胞與其他Th細胞亞群互相調(diào)控，使機體處于平衡狀態(tài)。

Th22細胞介導(dǎo)了多種由上皮細胞參與的自身免疫性和慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。研究證實，在刀豆蛋白A（ConA）及四氯化碳誘導(dǎo)的肝炎中，IL-22具有抑制炎癥反應(yīng)和保護肝細胞的作用[16-17]。但在慢性乙型病毒性肝炎中，其作用存在著爭議：有學(xué)者認為IL-22能夠促進非特異性炎癥細胞浸潤，并放大特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的效應(yīng)，從而促進由炎癥反應(yīng)引起的肝損[18-19]；而有些學(xué)者則認為，肝炎患者IL-22濃度的增高是在炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)下的代償性增高，其實質(zhì)是肝細胞保護性細胞因子，在肝炎中起到抑制肝臟炎癥反應(yīng)并參與肝組織損傷修復(fù)的作用[20]。RADAEVA等[17]通過阻斷肝臟中的IL-22表達進行研究，發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transduction and transcriptional activator，STAT3）在肝組織中的表達降低，肝組織損傷加重；而注射重組IL-22后，肝組織的損傷程度又降低，這一結(jié)果提示IL-22具有保護甚至修復(fù)肝組織的作用。本研究中，乙肝肝硬化患者及肝癌伴肝硬化患者的Th22細胞及IL-22因子均高于慢性乙型肝炎患者和健康受檢者，而慢性乙型肝炎與健康受檢者之間卻并無差異，說明Th22細胞及IL-22因子主要在肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中呈現(xiàn)差異表達，其具體機制如何，是炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)下的代償性增高，還是機體的損傷修復(fù)作用的表現(xiàn)，需要進一步的研究證實。

JIANG等[21]通過長期觀察從肝炎發(fā)展至肝細胞肝癌的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)IL-22在促進肝細胞損傷后修復(fù)的同時，卻加速了肝細胞從慢性炎癥向肝細胞肝癌的轉(zhuǎn)化，認為IL-22可能促進了肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但其中的機制尚不明確。有臨床研究報道，肝細胞肝癌伴肝硬化組織中的Th22細胞含量及IL-22表達水平高于周圍正常肝組織，肝細胞肝癌伴肝硬化患者外周血中的Th22細胞及IL-22水平亦高于正常人群，提示體內(nèi)Th22細胞含量與肝細胞肝癌之間存在相關(guān)性[22]。而RADAEVA等[17]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞株HepG2中，過表達的IL-22通過激活STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘導(dǎo)抗凋亡反應(yīng)，通過促進有絲分裂蛋白（myc，cyclin D1，Rb2，CDK4）的表達而促進肝癌細胞的生長。本研究中肝癌伴肝硬化患者的Th22細胞含量及IL22表達水平均高于乙肝肝硬化患者，且早期肝癌中Th22細胞含量及IL-22表達水平顯著低于中晚期肝癌，提示其與肝細胞癌存在正相關(guān)性，但其高表達是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的伴隨現(xiàn)象，還是與JIANG等[21]的小鼠模型中情況類似，為一種促癌機制，則需要更多的研究來闡述。