兒茶酚雌激素介導(dǎo)慢性間歇低氧誘導(dǎo)OSAHS雌性大鼠遺尿模型的建立

徐莉，蘇苗賞，蔡曉紅，李昌崇

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027）

夜間遺尿癥（nocturnal enuresis，NE）是指5歲以上兒童夜間不自主排尿[1]。一般認(rèn)為5～6歲患兒出現(xiàn)尿床＞2次/月，6歲以上患兒出現(xiàn)尿床＞1次/月可診斷為NE[2-3]。目前NE的病因尚不明確，研究報(bào)道顯示NE與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）相關(guān)。NE的患病率為4%～10%，OSAHS患兒伴發(fā)遺尿的概率高達(dá)10%～40%[4-5]，提示慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）可能是患兒出現(xiàn)遺尿的重要原因之一。CIH誘發(fā)OSAHS可產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使雌激素羥化代謝，即促進(jìn)兒茶酚雌激素（catechol estrogen，CE）大量生成[6]，并通過(guò)抑制兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（catecholamine-O-methyl transferase，COMT）的活性，使CE不能代謝為水溶性化合物，導(dǎo)致膀胱不穩(wěn)定，從而出現(xiàn)遺尿。OSAHS引起交感神經(jīng)興奮，導(dǎo)致兒茶酚胺類化合物如腎上腺素（adrenaline，Adr）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NA）和多巴胺（dopamine，DA）大量堆積，最終導(dǎo)致NE。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)遺尿的動(dòng)物模型少見報(bào)道，SD大鼠是夜行動(dòng)物，晝伏夜出，具有與人類相似的睡眠結(jié)構(gòu)，是研究睡眠的理想動(dòng)物模型[7]。本研究通過(guò)CIH誘導(dǎo)建立OSAHS遺尿的雌鼠模型，初步探討CE在CIH誘導(dǎo)OSAHS遺尿中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SPF級(jí)SD大鼠16只，雌性，體質(zhì)量（150±14）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，常規(guī)飼料和自來(lái)水無(wú)限制按時(shí)供應(yīng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-

0001。主要儀器及試劑：復(fù)合式大鼠試驗(yàn)?zāi)M艙，RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），NA、CE、COMT、Adr和DA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)公司），蘇木素-伊紅染液、改良Weigert彈力纖維染色液（美國(guó)Solarbio公司），烏拉坦（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及CIH實(shí)驗(yàn)：將16只SD雌鼠隨機(jī)分成CIH組及對(duì)照組，各8只，2組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將CIH組置于常壓間歇低氧艙，氧艙條件設(shè)置方法如下：以0.3 kPa壓力通氮?dú)?0 s，停30 s，25 L/min流量通氧氣12 s，停18 s為1個(gè)循環(huán)。艙內(nèi)低氧時(shí)氧濃度為9.0%±1.5%，復(fù)氧時(shí)氧濃度為21.0%±0.5%，艙內(nèi)CO2濃度＜0.01%?；诖笫笠归g活動(dòng)白天睡眠的生活特性，每天進(jìn)氧艙時(shí)間安排在9：00～17：00，每天8 h，模擬人體睡眠過(guò)程中CIH，其余時(shí)間移至動(dòng)物房，常規(guī)飼料和自來(lái)水喂養(yǎng)，每周7 d，連續(xù)放置4周構(gòu)造CIH組。通氣階段由連接的測(cè)氧儀分別測(cè)間歇低氧艙內(nèi)的氧濃度高值、低值和CO2濃度。對(duì)照組則置于同等條件下的空氣模擬對(duì)照艙，通壓縮空氣，氧濃度保持在21.0%±0.5%，同一單片機(jī)程序控制。

1.2.2 膀胱造瘺術(shù)及排尿閾檢測(cè)：缺氧4周后，腹腔注射烏拉坦（0.9 g/kg，1 mL/100 g）麻醉成功后，將大鼠仰臥位固定在鼠板上。腹部正中切口暴露膀胱，于膀胱頂切開一小口，插入連續(xù)硬膜外麻醉導(dǎo)管，絲線荷包縫合固定且不發(fā)生漏尿。接三通管一端與RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)第一通道相連，另一端與注射器相連，注入0.9%氯化鈉溶液，當(dāng)尿道口剛出現(xiàn)尿液時(shí)，使用配套數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)檢測(cè)并記錄排尿閾。

1.2.3 取材、病理學(xué)檢查：缺氧4周后，2組大鼠在檢測(cè)完成后即刻取出膀胱，稱重后用4%多聚甲醛固定。膀胱組織石蠟切片（片厚5 μm），按試劑盒說(shuō)明分別行HE和Weigert染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

1.2.4 兒茶酚胺類化合物水平及COMT活性測(cè)定：從 心臟取血3～4 mL放在試管內(nèi)，4 ℃，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，用ELISA法檢測(cè)血清中CE、NA、Adr和DA含量及COMT活性。具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，2組間比較用兩獨(dú) 立樣本t檢驗(yàn)，造模前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠一般情況 在造模期間，對(duì)照組大鼠活動(dòng)、飲食均正常，皮毛有光澤；CIH組大鼠活動(dòng)明顯減少，出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲鈍、多尿、毛發(fā)干枯等癥狀。

2.2 2組大鼠的排尿量 由于氧艙內(nèi)維持在低氧濃度，CIH組均處于睡眠狀態(tài)，出氧艙時(shí)發(fā)現(xiàn)CIH組有排尿，而對(duì)照組無(wú)排尿。造模期間2組大鼠24 h進(jìn)食量及進(jìn)水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模前2組大鼠24 h尿量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后與造模前24 h尿量比較，對(duì)照組大鼠的排尿量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CIH組大鼠排尿量增多，且較對(duì)照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將2組雌鼠進(jìn)出氧艙期間的排尿量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CIH組大鼠氧艙內(nèi)排尿量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而2組出氧艙后的排尿量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 兒茶酚胺類化合物含量及COMT活性 研究發(fā)現(xiàn)CIH組雌鼠血清中CE、NA、Adr和DA含量較對(duì)照組明顯增高，而其代謝酶COMT活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 2組雌鼠的生物學(xué)指標(biāo)、血清兒茶酚胺類化合物水平及代 謝酶活性比較（n=8，±s）

表1 2組雌鼠的生物學(xué)指標(biāo)、血清兒茶酚胺類化合物水平及代 謝酶活性比較（n=8，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與CIH組造模前24 h尿量比：cP＜0.05

指標(biāo) 對(duì)照組 CIH組體質(zhì)量（g） 150.21± 5.30 150.50± 3.20 24 h進(jìn)食量（g） 5.13± 1.25 4.80± 0.47 24 h進(jìn)水量（g） 38.92± 6.13 40.60± 4.35造模前24 h尿量（g） 12.80± 1.12 13.00± 1.06造模后24 h尿量（g） 10.52± 2.03 28.40± 8.08ac尿量（g） 氧艙內(nèi) 0 13.20± 3.08a 氧艙外 9.24± 1.78 12.80± 4.31膀胱質(zhì)量（mg） 78.63± 9.45 82.50± 7.56血清CE（pg/mL） 342.74± 20.73 391.10± 22.39b血清Adr（ng/mL） 10.06± 1.08 11.30± 0.50b血清NA（ng/mL） 3.65± 0.35 4.20± 0.28a血清DA（pg/mL） 783.21±169.82 1 199.60±144.22b COMT（U/mg prot） 194.10± 19.05 171.20± 10.33b

2.4 排尿閾 排尿閾是指開始排尿（即尿道口剛出現(xiàn)尿液）時(shí)，膀胱內(nèi)的壓力值。缺氧4周后，CIH組大鼠排尿閾為（33.80±15.05）mmHg（1 mmHg= 0.133 kPa），對(duì)照組大鼠為（125.47±79.31）mmHg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.5 膀胱組織HE及Weigert染色 缺氧4周后，HE及Weigert染色后光鏡觀察2組的病理變化如圖2所示。對(duì)照組大鼠HE染色切片可見膀胱逼尿肌肌束排列整齊、有序，間隙中充滿結(jié)締組織，連接緊密；而CIH組大鼠的膀胱逼尿肌肌束排列紊亂、疏松，部分肌束發(fā)生斷裂。對(duì)照組大鼠Weigert染色切片可見膀胱逼尿肌肌束排列整齊，間隙中含有膠原纖維（紅色深染部分）；而CIH組大鼠的膀胱逼尿肌肌束排列紊亂，間隙中的膠原纖維含量減少，間隙明顯增寬。

圖1 缺氧4周后2組雌鼠的排尿閾曲線圖

3 討論

NE的病因比較復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]，NE與遺傳因素、膀胱容量小、排尿中樞發(fā)育遲緩、睡眠覺(jué)醒障礙及OSAHS等有關(guān)。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上常用藥醋酸去氨加壓素（彌凝）對(duì)OSAHS誘發(fā)遺尿的療效并不理想，且長(zhǎng)期使用還有低血鈉等不良反應(yīng)。為了尋求療效好而不良反應(yīng)小的藥物，使更多的遺尿患者獲益，本研究通過(guò)模擬OSAHS的CIH病理生理過(guò)程，建立CIH誘發(fā)的遺尿雌鼠模型，以為進(jìn)一步闡明CIH誘發(fā)遺尿的發(fā)病機(jī)制提供可靠的動(dòng)物模型。

圖2 缺氧4周后膀胱組織病理染色圖（A、B：HE染色，×200；C、D：Weigert染色，×200）

本研究在前期的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，學(xué)齡期女性兒童OSAHS與遺尿顯著相關(guān)，且隨著缺氧程度的加重更容易發(fā)生遺尿，并且患病率是男性兒童的5倍[4]，因此本項(xiàng)目選用幼年SD雌鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，雌激素羥化代謝存在性別差異。雌鼠中以2-羥化為主，而雄鼠以2、16-羥化為主。雌激素羥化代謝是在細(xì)胞色素P450催化下完 成，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物CE。OSAHS可引起交感神經(jīng)過(guò)度興奮，誘發(fā)腎上腺軸等神經(jīng)內(nèi)分泌器官大量釋放NA、Adr和DA等兒茶酚胺類化合物，最終導(dǎo)致遺尿。CIH誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)可增強(qiáng)其催化作用，并以C2位羥化為主，促進(jìn)CE的大量生成，導(dǎo)致DNA損傷和突變，引起多器官損害，使OSAHS患者膀胱不穩(wěn)定，產(chǎn)生遺尿。在人體中，CE還存在保護(hù)代謝，即通過(guò)COMT的甲基化，使CE代謝為可溶于水的2-甲氧基雌激素和4-甲氧基雌激素，排出體外。然而，OSAHS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可抑制COMT的活性，導(dǎo)致CE在體內(nèi)的大量堆積。本研究結(jié)果顯示CIH大鼠血清中CE含量較對(duì)照組明顯增高，而COMT的活性明顯降低，提示CIH誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使CE大量堆積，從而導(dǎo)致膀胱的不穩(wěn)定性和遺尿的產(chǎn)生[6]。研究還發(fā)現(xiàn)CIH大鼠血清中兒茶酚胺類化合物含量明顯增多，提示CIH可通過(guò)過(guò)度興奮交感神經(jīng)，誘發(fā)遺尿。

既往的臨床研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS患兒打鼾癥狀減輕后，其遺尿癥狀也獲得改善。PARK等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在行腺樣體和（或）扁桃體切除術(shù)前，有17例（占9.3%）OSAHS患兒伴有遺尿，術(shù)后僅4例（占1.5%）OSAHS患兒仍有遺尿。THOTTAM等[10]也發(fā)現(xiàn)有51.4% OSAHS患兒的遺尿癥狀在行腺樣體和（或）扁桃體切除術(shù)后緩解?？赡苁怯捎贠SAHS患兒上呼吸道梗阻癥狀消除后，通氣功能和睡眠結(jié)構(gòu)獲得改善，從而緩解遺尿癥狀。這為OSAHS誘發(fā)的遺尿提供一種新的防治策略。

CIH是目前公認(rèn)的OSAHS主要的病理生理特征，并且可導(dǎo)致多系統(tǒng)功能損害。CAI等[11]通過(guò)CIH誘導(dǎo)建立OSAHS動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)其海馬功能區(qū)受損導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。GOZAL等[12]通過(guò)CIH誘導(dǎo)建立大鼠模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)幼鼠因腦缺氧導(dǎo)致覺(jué)醒功能障礙。臨床上通過(guò)睡眠監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，OSAHS患兒睡眠覺(jué)醒功能障礙主要表現(xiàn)為反復(fù)微覺(jué)醒[13]。WOLFISH等[14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS患兒伴有遺尿與健康同齡兒童相比，微覺(jué)醒次數(shù)明顯增多。劉英華等[15]研究報(bào)道，經(jīng)間歇性缺氧（4周）誘導(dǎo)后，SD幼鼠可出現(xiàn)遺尿，且通過(guò)腦電圖監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)遺尿與覺(jué)醒功能不良有關(guān)。由于頻繁間歇缺氧導(dǎo)致膀胱感受器興奮增強(qiáng)，誘發(fā)遺尿[16]。本研究基于前期的臨床研究發(fā) 現(xiàn)，采用CIH誘導(dǎo)雌鼠以建立OSAHS遺尿模型，并且結(jié)合OSAHS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致CE的大量生成，以進(jìn)一步闡明CIH誘發(fā)遺尿的尿動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制。

膀胱不穩(wěn)定是導(dǎo)致遺尿的另一重要原因。膀胱排尿是一種復(fù)雜的正反饋反射過(guò)程，排尿過(guò)程是逼尿肌和內(nèi)括約肌協(xié)同作用的結(jié)果，并且還受意識(shí)控制。睡眠時(shí)排尿減少是由于內(nèi)括約肌的作用及尿感神經(jīng)信號(hào)減弱。OSAHS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可促進(jìn)CE的大量生成，使尿感神經(jīng)傳入信號(hào)增強(qiáng)，引起膀胱逼尿肌和括約肌不穩(wěn)定性收縮，從而誘發(fā)遺尿。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CIH組雌鼠血清中兒茶酚胺類化合物含量明顯增高，排尿閾明顯降低，提示CIH組更易產(chǎn)生排尿現(xiàn)象，推測(cè)可能與膀胱不穩(wěn)定有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，2組雌鼠24 h進(jìn)食量及進(jìn)水量、膀胱大小及質(zhì)量、造模前24 h尿量及出氧艙后的排尿量均無(wú)明顯差異，但CIH組雌鼠較對(duì)照組在進(jìn)氧 艙時(shí)排尿量明顯增多，并且血清中CE也明顯增高，說(shuō)明CIH可誘發(fā)雌激素羥化代謝途徑，從而促使OSAHS雌鼠遺尿模型的成功建立。雖然2組雌鼠膀胱質(zhì)量無(wú)明顯差異，但光鏡下發(fā)現(xiàn)，CIH組的膀胱逼尿肌已經(jīng)發(fā)生病理形態(tài)學(xué)改變，提示存在膀胱組織的重塑。研究表明，在光鏡下觀察大鼠膀胱逼尿肌產(chǎn)生的最常見的病理改變是肌束排列紊亂、間隙增寬及肌束之間的膠原纖維含量減少[17]。目前關(guān)于OSAHS遺尿大鼠膀胱逼尿肌發(fā)生的一系列形態(tài)學(xué)改變的原因尚不明確，可能與支配膀胱的神經(jīng)中樞和（或）周圍神經(jīng)發(fā)生病變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CIH組膀胱逼尿肌肌束排列紊亂，間隙增寬，肌束之間的膠原纖維含量減少。以上膀胱組織結(jié)構(gòu)的病理變化將導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮功能受損，產(chǎn)生遺尿。

美國(guó)兒科學(xué)會(huì)、睡眠障礙聯(lián)合會(huì)及國(guó)際兒童控尿?qū)W會(huì)等指南[18-20]均認(rèn)為，OSAHS與遺尿關(guān)系密切。本研究結(jié)果表明，幼年SD雌鼠經(jīng)CIH誘導(dǎo)后，可因膀胱不穩(wěn)定及膀胱逼尿肌收縮功能受損產(chǎn)生遺尿，并且提示可能與覺(jué)醒功能障礙有關(guān)。這與OSAHS患兒出現(xiàn)遺尿時(shí)的臨床癥狀相似，因此本研究建立的CIH遺尿雌鼠模型可作為用于探討其發(fā)病機(jī)制的較理想的動(dòng)物模型。