桔梗皂苷D協(xié)同多西他賽促進侵襲性前列腺癌細胞PC3的凋亡*

葛東升 朱麗莉 王鶯語 羅 嘉 吳國勝** 馮寧翰, **

1. 南京醫(yī)科大學附屬無錫第二醫(yī)院泌尿外科（江蘇 214002）2. 江南大學無錫醫(yī)學院

內分泌的去勢治療（androgen deprivation therapy，ADT）是目前前列腺癌主要的治療方法，大多數(shù)患者早期對其比較敏感，但經(jīng)過1～2年治療后，最終會進展為去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC），這類前列腺癌預后較差，是臨床治療的難點[1]。

多西他賽（docetaxel, DTX）是半合成紫杉醇的衍生物, 也是一種典型的細胞毒性藥物，具有廣譜高效的抗腫瘤活性。它可通過加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使細胞形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細胞的有絲分裂,并阻滯細胞于G2/M期，最終導致腫瘤細胞凋亡。同時，DTX可以誘導腫瘤細胞中抑制凋亡的B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）磷酸化、提高游離BAX（Bcl-2 Associated X Protein, BAX）蛋白水平并最終促進細胞凋亡。DTX在1998年獲美國FDA批準上市，是被FDA批準用于治療CRPC的首個藥物，以其為主的抗腫瘤藥物聯(lián)合治療是目前CRPC治療標準方案。

桔梗皂苷D（Platycodin D, PD）是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動脈粥樣硬化等功能[2-4]。還可以通過誘導細胞自噬抑制腫瘤細胞生長，如白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌以及前列腺癌[5]。

基于上述研究基礎，我們提出PD與DTX聯(lián)合應用治療非雄依賴的前列腺癌的設想。本研究選取非雄激素依賴的細胞株PC3細胞，通過體外細胞培養(yǎng)觀察PD及DTX單獨及聯(lián)合應用對PC3細胞增殖和凋亡的影響，并進一步探討其內在分子機制，以明確PD聯(lián)合DTX對非雄激素依賴前列腺癌的潛在治療效果。

材料和方法

一、材料

PD為澳門大學中華醫(yī)藥研究院陸金鍵博士饋贈，將PD粉末完全溶于二甲基亞砜，配制為20 mmoL溶液。DTX購于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，將DTX用二甲基亞砜稀釋1000倍，得到濃度為49.5 nmoL溶液。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）、凋亡相關蛋白（Cleaved PARP）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR，ser2448）、磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR，tyr1068）、Bcl-2、BAX、酵母Agt-6同系物（Beclin-1）、自噬相關蛋白-5（Autophagy-related protein-5，Agt-5）、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ（microtubuleassociatedprotein1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ, LC3-Ⅰ/Ⅱ）以及β微管蛋白（β-tubulin）均購自美國Cell Signaling Technology公司。蛋白定量試劑盒（BCA試劑盒）購自美國Thermo Fisher Scienti fi c公司。噻唑藍（MTT），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）購自上海碧云天生物技術有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒（FITC-Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）購于美國BD pharmingen公司。

二、細胞培養(yǎng)

PC3購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每2～4天傳代一次。

三、MTT法細胞增殖抑制試驗

取對數(shù)生長期細胞，均勻種入96孔板，每個孔約為10 000個細胞，培養(yǎng)24h完全貼壁后，按照每個濃度設4個平行孔，將孔板分為4組，第四組作為對照組，先向第一、三組加入PD濃度為2.5 μmoL、5 μmoL、10 μmoL、20 μmoL、40 μmoL和80 μmoL的預配好的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6h后， 棄去細胞上層藥液，向第一組加入完全培養(yǎng)基，第二和第三組分別加入DTX濃度為2.5 nmoL、5 nmoL、10 nmoL、20 nmoL、40 nmoL和80 nmoL的預配好的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋至1mg/mL的MTT溶液，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，小心吸棄上清，向每個孔加入二甲基亞砜150 μL溶解甲臜晶體，采用BioTek Synergy H4 全功能微孔板檢測儀在波長490 nm處檢測各孔吸光度（OD）值，并計算藥物對細胞生長的抑制率。

四、Western blot

將PD和DTX處理好的細胞用PBS洗兩次，加入適量細胞裂解液，刮下細胞，移入1.5 mL EP管中，超聲破碎，然后冰上孵育20min，之后于4℃，4 000×g離心20 min，取上清，得到細胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度，蛋白樣品上樣量為每孔30 μg。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將分離后的蛋白電轉移印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗3次，每次10min，放入相應抗體中（體積稀釋比例都是1：1000），4℃搖床上孵育過夜，TBST洗膜后，于辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1：2000）室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min。然后用ECL試劑盒曝光顯色。

五、DAPI 染色

將經(jīng)過PD和DTX處理好的細胞吸棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每個孔加入800 μL多聚甲醛固定，10min后吸棄上清，用PBS洗兩次，避光，加入配置好的DAPI溶液，并將孔板用錫紙嚴密包好，置于水平搖床孵育10min，用ZEISS全自動正置熒光顯微鏡進行熒光拍照。

六、流式細胞儀檢測細胞凋亡率

將六孔板中用PD和DTX處理好的細胞全部分別收集至15mL離心管（包括上清中的細胞和PBS洗下的細胞），200×g，4℃離心5min，用預冷的PBS洗兩次，于100 μL 的1×Binging Buffer中重懸，每個樣品中加入5 μL 依賴性磷脂結合蛋白（FITCAnnexinV）和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光染色30min，用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

七、統(tǒng)計學方法

運用SPSS 13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和檢驗。所有實驗重復3次，多個組別間比較運用單因素方差分析（One-way ANOVN）。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、PD和DTX協(xié)同抑制PC3細胞的生長

PD和DTX均能抑制PC3細胞的生長，且PD呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（圖1）。在PD和DTX聯(lián)合作用之后可以顯著抑制PC3細胞生長。圖1A為聯(lián)合用藥的加藥方案，即在PD作用6h之后撤藥，然后加入DTX繼續(xù)作用24h，單獨用藥為PD組只加PD處理6h，DTX組只用DTX處理24h。圖1B為不同濃度的PD和DTX作用于PC3，對其增殖的影響，表1顯示在PD和DTX濃度分別在2.5 μmoL和2.5 nmoL，5 μnmoL和5 nmoL，10 μmoL和10 nmoL，20 μmoL和20 nmoL時聯(lián)合用藥對PC3細胞增殖具有協(xié)同抑制作用，且在20 μmoL PD和20 nmoL DTX聯(lián)合使用時，協(xié)同作用最為顯著，與PD組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.001），與DTX組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 比較PD、DTX單獨和聯(lián)合用藥對PC3細胞的生長抑制作用

表1 PD和DTX對PC3的抑制率以及協(xié)同系數(shù)

二、 PD和DTX聯(lián)合用藥促進PC3細胞凋亡

PC3細胞種于六孔板中，分別以20μmoL PD處理6h，20nmoL DTX處理24h以及20μmoL PD處理6h后撤藥再用20nmoL DTX處理24h，觀察細胞形態(tài)學變化，進行DAPI染色，凋亡率檢測，以及凋亡相關蛋白的表達情況。

觀察PD，DTX和PD聯(lián)合DTX，對PC3細胞形態(tài)的影響，由圖2A可見，PD和DTX均可導致細胞形態(tài)發(fā)生一定程度的變化，在PD聯(lián)合DTX用藥中發(fā)現(xiàn)細

胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，絕大多數(shù)細胞由梭形變?yōu)閳A形，并且內部產(chǎn)生空泡狀結構，貼壁細胞數(shù)量也有所降低。在圖2B中能觀察到PD、DTX和PD聯(lián)合DTX作用于PC3細胞的DAPI染色結果，DAPI作為一種DNA染料，可以檢測細胞凋亡，對照組和PD組染色核形完整，染色質均勻，說明未發(fā)生凋亡；DTX組中發(fā)現(xiàn)少量的細胞核固縮，說明有部分細胞發(fā)生了早期凋亡；而在PD和DTX聯(lián)合用藥組發(fā)現(xiàn)細胞核進一步固縮，形成顆粒物，甚至細胞核破裂形成碎片，說明多量的細胞發(fā)生凋亡。 為進一步明確PC3細胞的凋亡率，運用流式細胞技術對PD，DTX和PD聯(lián)合DTX作用過的PC3細胞進行AnnexinV和PI雙染，然后運用流式細胞儀進行檢測，如圖2C所示，PD和DTX聯(lián)合用藥組凋亡率均高于PD和DTX單獨用藥組。并且在Western blot的結果顯示（圖2D），在PD和DTX聯(lián)合用藥組中Cleaved PARP表達量顯著增高，說明PD聯(lián)合DTX作用于PC3細胞可以顯著增加PC3細胞凋亡。

三、PD聯(lián)合DTX協(xié)同誘導PC3細胞凋亡的機制

PD可以誘導多種腫瘤細胞發(fā)生自噬[5]，在圖2A中，PD組細胞產(chǎn)生多量空泡狀結構，推測PD和DTX聯(lián)合使用的協(xié)同效應可能與PD誘導PC3細胞發(fā)生自噬有關，在圖3A中，PD組以及PD和DTX聯(lián)合用藥組LC3-II表達量較其他組增多，表明在PD處理6h后PC3細胞已經(jīng)發(fā)生自噬。在圖3B中，DTX組和PD聯(lián)合DTX組均可導致p-mTOR（ser2448）和p-EGFR（tyr1068）表達量明顯減低，這可能與細胞發(fā)生凋亡的具體機制相關。

圖3 PD和DTX對PC3細胞凋亡機制的探究

討 論

前列腺癌是男性前列腺泡或導管上皮來源的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美等發(fā)達國家和地區(qū)，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲尤其是我國，前列腺癌發(fā)病率雖低于西方國家，但近年來呈顯著增長且年輕化趨勢[6,7]。目前認為，前列腺癌發(fā)病率的持續(xù)增高和遠處轉移依賴于雄激素受體傳導信號，因此ADT療法是除外科手術與放射治療外的標準前列腺癌治療方法，可以暫時抑制前列腺癌細胞的生長，延緩疾病的惡化進展。盡管80%～90%的早期前列腺癌患者都會對ADT治療有效果，但幾乎所有患者都會在1～2年內復發(fā)并由雄激素依賴性前列腺癌發(fā)展成高度惡化且廣泛轉移的雄激素非依賴性前列腺癌，使常規(guī)的ADT療法失去效果，成為臨床治療的難點。目前臨床用于治療前列腺癌的藥物雖已顯示出強大的功效，但也存在一些弊端，單獨用藥劑量大、副作用大（如耐藥性、不良反應等），而且抗癌治療藥物一般價格昂貴，大大增加了患者的醫(yī)療負擔。因此，發(fā)現(xiàn)新的高效藥物成為現(xiàn)階段臨床治療亟待解決的問題。有鑒于此，本研究試圖從藥物協(xié)同作用入手，將傳統(tǒng)中藥有效成分與臨床一線化療藥物結合，優(yōu)化治療方案，降低治療成本，提高治療效果，探索前列腺癌疾病新的藥物治療策略。

紫杉烷是一種典型的細胞毒藥物，具有高效廣譜的抗腫瘤活性，可與微管蛋白的亞基結合抑制微管動力學，誘導腫瘤細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯[8]，亦可通過激活多條信號轉導通路誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[9-12]。DTX是第2代紫杉烷衍生物，由歐洲紅豆杉提取的非細胞毒性前體化合物10-脫乙?；涂ㄍあ螅?0-DAB Ⅲ）經(jīng)半合成而成，1998年獲美國FDA批準上市[13]。與紫杉醇相比，DTX有更強的微管蛋白親和力和更長的細胞內停留時間，對腫瘤細胞的破壞力更強。它有一定的靶向性和具有減少藥物劑量、降低毒副作用，尤其是減少過敏反應發(fā)生的特點。然而因患者自身耐受差、藥物選擇性弱等原因亦導致化療失敗或復發(fā)，使其療效欠佳。因此，為降低DTX的毒副作用，增強其療效，尋找有效的輔助治療藥物成為亟待解決的關鍵問題。

桔梗，俗稱氣球花，是一種傳統(tǒng)中草藥，味苦、辛，平。歸肺經(jīng)。其主要功能為宣肺，利咽，祛痰和排膿。在中國、日本及韓國桔梗被廣泛用作飲食來源以及治療呼吸系統(tǒng)疾病的藥物。PD是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動脈粥樣硬化等功能[2-4,14-16]。Chun等通過對人胃癌細胞（AGS）的研究表明，PD可顯著性地抑制其增殖并介導失巢凋亡，這種細胞凋亡與外源性的Fas受體通路及內源性的線粒體Bcl-2家族通路有關[17]；同時，PD介導的p38等應激活化蛋白激酶的磷酸化可能是其引起AGS凋亡的一個原因。Kim等通過研究人白血病細胞（U937,THP-1及K562），發(fā)現(xiàn)PD可在體外抑制白血病細胞的增殖，并介導其凋亡，其機制是為降低c-Myc和Spl蛋白的表達水平，并下調其與DNA的結合能力，通過Ark途徑抑制hTERT的磷酸化和核轉位，發(fā)揮抑制細胞增殖的作用[18]；此外，Shin等報道，PD通過抑制Egr-1的活化、ROS的產(chǎn)生、MMP的分解，及活化Caspase-3，在誘導人白血病細胞（U937）凋亡的過程中發(fā)揮作用[19]。近年來，有許多研究表明PD在誘導細胞自噬中也發(fā)揮重要作用，如PD能夠誘導人肝癌細胞BEL-7402形成脂質空泡，提高細胞內自噬標志物LC3-Ⅱ水平，使細胞自噬[20]；在非小細胞肺癌中，PD可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑并激活JNK和p38-MAPK信號傳導途徑誘導自噬[21]。本研究中，在PD處理細胞6h后可以發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)了明顯的自噬（圖2A和圖3A），符合上述文獻的報道。在后續(xù)DTX處理24h后，明顯促進了DTX介導的凋亡。基于此結果，我們推斷PD介導的PC3自噬使細胞處于應激狀態(tài)，腫瘤細胞通過自噬的作用一方面提供細胞生長的能量物質，另一方面保證細胞的存活。在此基礎上，加入細胞毒藥物DTX打破了細胞內部的能量平衡，使細胞更傾向于發(fā)生凋亡。在具體分子機制研究方面，我們檢測了與細胞能量代謝相關的EGFR和mTOR的激活情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥后，進一步抑制了相關信號通路，具體機制仍需進一步闡明。

總之，通過本研究，我們揭示PD與DTX協(xié)同作用這一用藥方案對誘導前列腺癌細胞凋亡的優(yōu)勢，進一步挖掘了傳統(tǒng)中藥中的單體化合物通過協(xié)同用藥在前列腺癌治療中的潛力，為有效醫(yī)治前列腺癌提供新的藥理學參考。