洛陽(yáng)煙區(qū)煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒定

陳奇園，丁鑰琪，趙世民，李淑君，康業(yè)斌*

1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南省洛陽(yáng)市開元大道263號(hào) 471023

2.河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，河南省洛陽(yáng)市開元大道246號(hào) 471023

3.河南省農(nóng)科院許昌煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）侵染煙草引起的黑脛病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的毀滅性土傳真菌病害［1］。目前，煙草黑脛病的防治措施主要采用種植抗病品種、合理輪作與藥劑防治。然而，隨著煙草栽培制度的改變，抗病品種連年、大面積單一種植，極易導(dǎo)致其抗病性喪失。生產(chǎn)上常用的甲霜靈等幾種內(nèi)吸性殺菌劑對(duì)煙草疫霉作用位點(diǎn)單一，容易產(chǎn)生抗藥性而引起藥效下降，從而導(dǎo)致藥劑用量加大，使煙葉中的農(nóng)藥殘留增加、造成環(huán)境污染［2-4］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼開展了拮抗放線菌防治煙草病害的研究。Lukic等［5］從煙田土壤中分離出28株放線菌，其中兩株對(duì)12種煙草病原真菌有拮抗作用；Kortemaa等［6］報(bào)道了世界上已廣泛應(yīng)用的一種放線菌的活體制劑防治腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌和絲核菌等常見的土傳病原菌；Loqman等［7］從摩洛哥葡萄根際土壤中分離獲得142株放線菌，并測(cè)定了對(duì)尖孢鐮刀菌、終極腐霉、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌及白絹病菌的拮抗作用，其中有24株放線菌至少抗4種病原菌。周喜新等［8］從湖南長(zhǎng)沙瀏陽(yáng)市北盛鎮(zhèn)煙草黑脛病發(fā)病田健株根際土壤中分離純化獲得1株對(duì)煙草疫霉具有顯著拮抗作用的放線菌LY18，其發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉菌絲的抑制率達(dá)70%；王靜等［9］從山東省日照市五蓮縣于里鎮(zhèn)煙田健株根際土壤分離純化獲得1株拮抗放線菌F8，室內(nèi)測(cè)定對(duì)供試煙草疫霉具有較強(qiáng)的抑制作用，溫室盆栽試驗(yàn)防效為70.3%。但河南省煙田土壤中拮抗放線菌種類及開發(fā)應(yīng)用尚未見系統(tǒng)研究報(bào)道，為此，進(jìn)行了洛陽(yáng)地區(qū)煙草根圍土壤中拮抗放線菌的篩選與鑒定，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用拮抗微生物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙 草 疫 霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）以及從煙草根圍土壤分離的放線菌稀釋涂布平板均由河南科技大學(xué)植物病害分子鑒定與綠色防控實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基包括：高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、大豆酵母培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（編號(hào)：B518255）和 PCR擴(kuò)增試劑盒（編號(hào)：B532491）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根圍放線菌的純化

將高氏一號(hào)培養(yǎng)基融化，待冷卻至50℃左右，加入3%的重鉻酸鉀溶液使培養(yǎng)基中重鉻酸鉀濃度約100 mg/L，倒平板；待平板凝固后備用，用滅菌牙簽從前期試驗(yàn)保存的稀釋涂布平板上挑出菌落形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落至高氏一號(hào)平板上劃線分離、純化培養(yǎng)［10］，直至獲得單菌落。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

1.2.2.1 拮抗菌株的初篩

采用改良的平板對(duì)峙培養(yǎng)法［11］測(cè)定菌株對(duì)煙草疫霉的拮抗作用，保留抑菌率≥50%的菌株進(jìn)行復(fù)選。

1.2.2.2 拮抗菌株的復(fù)篩

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［12］測(cè)定初選菌株發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉的抑菌活性，選取抑菌率達(dá)100%的菌株進(jìn)一步鑒定其種類。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

用插片法［13］在普通光學(xué)顯微鏡（無(wú)錫瀚光光學(xué)科技有限公司）100倍油鏡下觀察記載其基內(nèi)菌絲體有無(wú)橫隔、是否斷裂；氣生菌絲體的特征；孢子鏈的形狀、著生方式；孢子的形狀等。

根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》［14］，將菌株分別接種在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)，分別在7、14、28 d后觀察菌株在不同培養(yǎng)基上氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長(zhǎng)狀況，是否有可溶性色素產(chǎn)生及其顏色。

1.2.3.2 生理生化特征觀察

參照《植病研究法》［12］和《放線菌的分類和鑒定》［15］進(jìn)行明膠液化、牛奶凝固和胨化、淀粉分解、纖維素水解、硫化氫與黑色素產(chǎn)生以及利用碳源產(chǎn)酸等試驗(yàn)，觀察生理生化特征。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（編號(hào)：B518255）說(shuō)明書進(jìn)行放線菌DNA的提取。以提取的DNA為模板，采用通用引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)放線菌16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 1.0 μL，10×Taq Buffer（NH4+）5.0 μL，dNTP Mix（10.0 mmol/L）1.0 μL ，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）3.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各 1.0 μL，加 dd H2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。檢測(cè)到合適的條帶后，將其所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物（未純化，45 μL）由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，用MEGA.6軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 根圍放線菌的純化

共挑出放線菌單菌落496個(gè)，進(jìn)一步分離純化獲得形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落227個(gè)。

2.2 拮抗菌株的篩選

2.2.1 拮抗菌株的初篩

表1顯示，有45株放線菌對(duì)煙草疫霉的抑菌率大于50%，其中25株的抑菌率大于70%。

表1 放線菌對(duì)煙草疫霉的抑制作用①Tab.1 Inhibition effects of actinomycetes against P.parasitica

2.2.2 拮抗菌株的復(fù)篩

表2表明，15株拮抗放線菌的發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉的抑菌率大于50%。其中，菌株YY75、YY124、LN204、LN221、LN247、SX92、YY135 和SX59的抑菌率達(dá)100%，確定為優(yōu)勢(shì)拮抗菌株。

2.3 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

菌株YY75孢子絲彎曲，孢子圓形；菌株LN204、LN221和LN247孢子絲螺旋形，孢子圓柱狀；菌株SX92孢子絲波曲，孢子桿狀；菌株YY124和YY135孢子絲圈卷，孢子桿狀；菌株SX59孢子絲螺旋形，孢子桿狀（圖1）。

表2 拮抗放線菌對(duì)煙草疫霉的抑制作用Tab.2 Inhibition effects of antagonistic actinomycetes against P.parasitica

在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色，無(wú)可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至灰色，基內(nèi)菌絲蜜黃色，無(wú)可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色，無(wú)可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，無(wú)可溶性色素。

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至褐色，可溶性色素黃色；菌株LN204、LN221和LN204少量灰色氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米黃色，無(wú)可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲褐綠至橄欖灰綠色，可溶性色素墨綠色；菌株YY124和YY135無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲紫紅色，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，可溶性色素米色。

在淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米綠色，無(wú)可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至鼠灰色，基內(nèi)菌絲微褐，無(wú)可溶性色素；菌株SX92無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米綠色，無(wú)可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至石南紫，基內(nèi)菌絲玫瑰色至紫紅色，無(wú)可溶性色素；SX59氣生菌絲古粉紅色，基內(nèi)菌絲玫瑰色至信號(hào)紅，無(wú)可溶性色素。

在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色至米綠色，無(wú)可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲沙紫灰至暗灰色，基內(nèi)菌絲淺灰至灰黃色，無(wú)可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲硫磺色，可溶性色素黃色；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅，無(wú)可溶性色素。

在葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色，無(wú)可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲無(wú)色至微黃，無(wú)可溶性色素；菌株SX92無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色，無(wú)可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲石南紫至酒紅紫，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲酒紅紫，無(wú)可溶性色素。

圖1 菌株的孢子絲和孢子形態(tài)（×100）Fig.1 Spore chains and spore morphology of antagonistic strains（×100）

在克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至葡萄酒紅，無(wú)可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲淺黃色至灰色，基內(nèi)菌絲蜜黃色，無(wú)可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色，無(wú)可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至古粉紅色，基內(nèi)菌絲粉紅至紫紅色，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲粉紅至橘紅，無(wú)可溶性色素。

在葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無(wú)氣生菌絲，基內(nèi)菌絲為象牙色至赭黃色，可溶性色素為黃棕色；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲為白至灰色，基內(nèi)菌絲米為褐色，無(wú)可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲為米褐色，可溶性色素為棕色；菌株YY124和YY135氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲為象牙色至火焰紅，無(wú)可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲為粉紅色，基內(nèi)菌絲也為粉紅色，無(wú)可溶性色素。

2.3.2 生理生化特性

優(yōu)勢(shì)拮抗菌株均可利用葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖和甘露醇等多種碳源，明膠液化、纖維素水解均為陽(yáng)性，而硫化氫的產(chǎn)生均為陰性；菌株YY135對(duì)牛奶的凝固和胨化反應(yīng)為陽(yáng)性；菌株YY75和SX92黑色素的產(chǎn)生反應(yīng)也為陽(yáng)性，見表3。

表3 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of dominant antagonistic strains

2.3.3 16S rDNA序列分析

將菌株LN204、LN221、LN247、SX59、YY124、YY135、YY75和SX92的16S rDNA序列提交至NCBI，登 錄 號(hào) 分 別 為 MH265958、MH265959、MH265960、MH265965、MH265966、MH265967、MH265968和MH265970。進(jìn)一步對(duì)8個(gè)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，菌株YY75的序列與登錄號(hào)為NR043827（Streptomyces lucensis）等序列同源性大于99%，菌株YY124和YY135的序列與登錄號(hào)為AB184370（S.nobilis）等序列同源性大于99%，菌株LN204、LN221和LN247的序列與登錄號(hào)為JX284411（S.rochei）等序列同源性大于99%，菌株SX92的序列與登錄號(hào)為AB184197（S.coralus）等序列同源性大于99%，菌株SX59的序列與登錄號(hào)為 AB249919（S.aureoverticillatus）等序列同源性大于99%。

3 討論

本試驗(yàn)中鑒定的8株優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌均屬于鏈霉菌屬，這與邊傳紅［17］從洛陽(yáng)煙草根際土壤中篩選鑒定的13株拮抗放線菌也均屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致；也與廖振林等［18］從廣西北海紅樹林土壤中篩選鑒定的10株拮抗放線菌，其中有8株屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致。說(shuō)明鏈霉菌屬是土壤放線菌中常見的屬。本試驗(yàn)中獲得的優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉抑制率均達(dá)100%，說(shuō)明發(fā)酵液中含有抑菌活性成分，這與Singh等［19］發(fā)現(xiàn)的S.lucensis可以產(chǎn)生魯薩霉素C和Anukool等［20］發(fā)現(xiàn)的S.rochei F20可以產(chǎn)生抗生素Streptothricin的試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明鏈霉菌屬是放線菌中主要產(chǎn)抗生素的屬。但有關(guān)鏈霉菌屬發(fā)酵液中活性成分分析、抑菌機(jī)理的研究以及盆栽防效試驗(yàn)與田間防治效果等仍有待進(jìn)一步的深入研究。

圖2 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of dominant antagonistic strains based on 16S rDNA sequences

4 結(jié)論

從洛陽(yáng)煙區(qū)煙株根圍土壤中分離純化共獲得227個(gè)放線菌單菌落，其中8株的發(fā)酵液對(duì)煙草疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)100%，被確定為優(yōu)勢(shì)拮抗放線菌。根據(jù)這些菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析結(jié)果，菌株YY75鑒定為魯薩鏈霉菌（S.lucensis），菌株YY124和YY135鑒定為高貴鏈霉菌（S.nobilis），菌株LN204、LN221和LN247鑒定為婁徹鏈霉菌（S.rochei），菌株SX92鑒定為珊瑚鏈霉菌（S.coralus），菌株SX59鑒定為金黃回旋鏈霉（S.aureoverticillatus），均屬于放線菌門、放線菌綱、鏈霉菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。