烏拉爾甘草不同溶劑提取物的美白活性比較研究

曹思瑤，宋 卓，林鑫宇，鐘 源，胡冬華

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

甘草是常用的大宗藥材[1]，在我國歷來就有“十方九草”之說[2]。烏拉爾甘草主產(chǎn)于東北、河北、內(nèi)蒙古、新疆等地區(qū)，有清熱解毒、補(bǔ)益心脾、可調(diào)和藥性、具有止咳平喘、緩急止痛之效?，F(xiàn)代藥理表明甘草具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、保肝、降血糖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功效[3]。甘草提取物可以美白肌膚，抵御自由基氧化，且溫和、不刺激、安全性高[4]，可廣泛應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域。

目前，國內(nèi)常用的美白劑主要有三種，分別為：化學(xué)類、生物類以及天然植物類?；瘜W(xué)美白劑具有效果顯著，但刺激較大的特點，會給肌膚帶來一定的損傷。生物美白劑由于生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、成本高，無法廣泛應(yīng)用[5]。天然植物類美白劑，尤其是中藥提取物類美白成分資源豐富且成分低，同時安全性高，越來越受到關(guān)注。

肌膚暗沉、發(fā)黑的最主要原因就是黑色素的生成。當(dāng)肌膚細(xì)胞受到如紫外線、惡劣天氣、防腐劑等外界刺激時，會產(chǎn)生過量的自由基。外界刺激作用于角質(zhì)形成細(xì)胞后，會使肌膚產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而激活黑色素形成的關(guān)鍵酶——酪氨酸酶，使黑色素的表達(dá)量在炎癥部位增加，導(dǎo)致黑色素聚集，加深肌膚顏色[6]。甘草提取物可通過抑制酪氨酸酶的活性和清除過量的自由基，有效阻止黑色素產(chǎn)生、抑制黑色素沉著，從而達(dá)到美白效果。故甘草提取物的美白活性可以用對酪氨酸酶的相對抑制率和對DPPH·自由基的清除率的綜合評分為評價指標(biāo)。

甘草提取物在抑制酪氨酸酶活性和清除自由基的基礎(chǔ)上，還有抗炎作用，可消除炎性因子，減少黑色素的聚集[7]。同時，甘草提取物中的甘草黃酮類可有效抵御紫外線輻射，減輕因紫外線照射而帶來的肌膚損傷[8]。甘草提取物可以從多個方面同時作用，阻止黑色素的生成，使肌膚美白透亮。

本文在傳統(tǒng)甘草提取方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)化妝品配方的需求，增加了丙二醇提取法，并運用紫外分光光度計法和高效液相色譜，對三種提取物的美白活性及有效成分進(jìn)行比較研究。

1 材料

1.1 設(shè)備 DF-101型 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市峪英儀器廠；UV-1780型 紫外分光光度計，日本島津公司；FA2004型 分析天平，上海天美天平儀器有限公司；800電動離心機(jī)，江蘇省金壇市江南儀器廠；RE-52A型 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮美生化儀器廠；JP-020S型 超聲清洗機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；LC-2030 型 高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 藥品與試劑 甘草，購于長春市中藥店，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知老師鑒定為烏拉爾甘草；L-酪氨酸，中國惠世生化試劑有限公司；酪氨酸酶（25 kU）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、甘草苷（純度≥98%），上海源葉科技有限公司；甘草酸（純度≥98%），北京百靈威科技有限公司。

2 方法

2.1 甘草三種不同溶劑提取物的制備 1）甘草水提取物采用豆康寧[9]等人的方法。5.0 g甘草粗粉，加入120 mL蒸餾水，99.1℃水浴提取120 min。以3 000 r/min離心3 min，取上清液，過濾，旋蒸濃縮至浸膏。浸膏用40%的丙二醇水溶液[10]溶解，定容至50.0 mL。2）甘草乙醇提取物采用魏寧等[11]方法，略有改動。5.0 g甘草粗粉，加入6倍量55% 的乙醇回流提取3次，1.5 h/次，合并濾液，過濾，旋蒸濃縮至浸膏。浸膏用40%的丙二醇水溶液溶解，定容至50.0 mL。3）甘草丙二醇提取物參考林宇祺[12]的方法，5.0 g甘草粗粉，按料液比1：5加入丙二醇，80.0 ℃水浴提取2 h，趁熱過濾，并用丙二醇洗滌殘渣兩次，定容至20.0 mL，再用蒸餾水將溶液稀釋至50.0 mL。

2.2 酪氨酸酶抑制活性的測定 將甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物原液用PBS緩沖液分別稀釋，即生藥濃度為10.0 mg/mL、20.0 mg/mL、40.0 mg/mL、80.0 mg/mL、100.0 mg/mL。參照張智萍[13]的方法，分別測定樣品原液及稀釋后的樣液對酪氨酸酶的相對抑制作用。按表1所示，用移液槍精準(zhǔn)量取T1、T2、T3、T4反應(yīng)液中的L-酪氨酸、PBS及樣液，以0.36 mg/mL的L-酪氨酸為底物，在pH = 6.8，0.4 mol/L的PBS緩沖溶液中加入樣液，分別置于4個PE管中，混勻后放入37 ℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，然后在T2、T4中分別加入1 mL的酶活力單位為200 U/mL的酪氨酸酶，恒溫10 min后，立即用紫外分光光度計測475 nm處吸光度，分別記為 AT1、AT2、AT3、AT4。將實驗重復(fù)三次，求相對抑制率的平均值。按公式（I）計算樣液對酪氨酸酶活性的相對抑制率（S）：S = [1-（AT4-AT3）/（AT2-AT1）]×100% （I）

式中：AT1、AT2、AT3、AT4分別是反應(yīng)液T1、T2、T3、T4的吸光度。

2.3 DPPH·自由基清除率的測定 分別吸取甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物原液用40%的丙二醇水溶液稀釋，即生藥為2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL。參照于佳[14]的方法，分別精確吸樣品溶液 2.0 mL 放入試管中，加入2.0×10.4 mol/L的DPPH·乙醇溶液2.0 mL，搖勻后置于暗處反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計測定其在517 nm處的吸光度值（Ai）；用2.0 mL DPPH·乙醇溶液加等體積的40%丙二醇水溶液為空白對照樣，測定其在517 nm處的吸光度值（Ao）；分別用2.0 mL甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物樣品溶液加等體積的40%丙二醇水溶液為樣品對照，測定其在517 nm處的吸光度值（Ax），以消除樣品本身顏色的影響。按公式（II）計算樣品對DPPH·自由基清除率（R）：R = [1 -（Ai - Ax）/Ao]×100% （II）

表1 反應(yīng)液組成

2.4 高效液相色譜法測定甘草酸和甘草苷含量的測定 按照1.2.1甘草不同溶劑提取物的制備方法，將甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物分別過0.22 μm濾膜。精確稱取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品81 mg、甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品13 mg，用甲醇定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，待用。本方法參照2015版藥典中規(guī)定的HPLC方法測定甘草酸及甘草苷的含量。色譜柱為伊特利C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為：乙腈（B）- 0.05%磷酸（A）；梯度洗脫（表2）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長237 nm；進(jìn)樣量20 μL。

表2 色譜條件

3 結(jié)果

3.1 甘草不同溶劑提取物對酪氨酸酶相對抑制作用的比較結(jié)果 酪氨酸酶為黑色素形成過程中的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性可分別抑制酪氨酸轉(zhuǎn)化為Dopa和Dopaquinone的過程[15]，從而減少黑色素的生成數(shù)量。本部分工作以酪氨酸酶抑制活性為重要考察指標(biāo)。如圖1所示，甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度IC50分別為：91.40 mg/mL、59.76 mg/mL、16.10 mg/mL；其中甘草丙二醇提取物對酪氨酸酶的抑制作用明顯高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。因甘草水提取物中的甘草多糖已在提取后，用離心操作除去，故甘草水提取物的主要成分為甘草酸和甘草皂苷及少量甘草苷[16]。研究表明甘草酸二銨、甘草皂苷和甘草苷對酪氨酸酶均有抑制作用[17-18]。由于甘草黃酮不易溶于水，但甘草黃酮對酪氨酸酶有一定的抑制作用，故甘草水提取對酪氨酸酶的抑制作用小于甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物。

圖1 3種不同溶劑的甘草提取物對酪氨酸酶活性的抑制情況

3.2 甘草不同溶劑提取物對DPPH·自由基的清除作用的比較結(jié)果 DPPH·自由基（1，1-二苯基苦基苯肼）檢測是通過分子中1個穩(wěn)定的DPPH自由基接受抗氧化劑提供的1個電子，形成穩(wěn)定的DPPH-H結(jié)構(gòu)，使DPPH的特征紫色變成黃色或無色，變色程度與抗氧化劑接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，可用于抗氧化劑清除自由基能力的評價[19-20]。

圖2 3種不同溶劑的甘草提取物對DPPH·的清除能力

如圖2所示，甘草水提取物、甘草乙醇提取物和甘草丙二醇提取物對DPPH·自由基清除作用的IC50分別為：14.46 mg/mL、7.16 mg/mL、6.08 mg/mL；其中甘草丙二醇提取物對DPPH·自由基的清除作用明顯高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。由于甘草黃酮可溶于堿水和有機(jī)溶劑，所以，溶劑乙醇和丙二醇可以提取出較多的甘草黃酮，而水溶液只能提取出少數(shù)種類的甘草黃酮。甘草水提取物中雜質(zhì)較多，不易過濾，且不易保存，容易產(chǎn)生白色絮狀物，使甘草提取物變得粘稠，這些因素可能會影響甘草水提取物對DPPH·自由基的清除作用，故我們的實驗研究表明，甘草水提取物應(yīng)分離純化后，再應(yīng)用到化妝品中。

3.3 甘草酸和甘草苷含量的比較分析 用高效液相色譜法，以甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品和甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品，對生藥濃度相同的甘草水提取物、甘草乙醇提取物以及甘草丙二醇提取物中甘草酸和甘草苷含量進(jìn)行比較分析。甘草苷和甘草酸的保留時間分別為：8.35 min和30.12 min。根據(jù)下圖可得：甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸含量明顯高于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。

在提取物甘草有效成分時，乙醇為最常用的有機(jī)溶劑。一般認(rèn)為增加乙醇的濃度有利于甘草總黃酮的提取，由于黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，高濃度的乙醇適用于提取黃酮苷元類，低濃度乙醇適用于提取黃酮苷類，由此可見甘草黃酮的提取效果受溶劑極性影響較大[21]?；谌軇O性的考慮，我們系統(tǒng)實驗研究表明，丙二醇可以作為提取甘草有效成分的優(yōu)良溶劑。對三種提取物的HPLC圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸的含量較多，甘草乙醇提取物和甘草水提物中甘草苷和甘草酸的含量相差不大；實驗發(fā)現(xiàn)，甘草丙二醇提取物和甘草乙醇提取物HPLC圖中在保留時間16 min～22 min時，出現(xiàn)甘草水提取物沒有的色譜峰。參照謝佳穎[22]等人的研究，推測其中含有異甘草素葡萄糖芹菜苷和異甘草苷，且甘草丙二醇提取物中這兩種物質(zhì)的含量也明顯高于甘草乙醇提取物，進(jìn)一步研究工作正在進(jìn)行中。

圖3 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品和甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

圖4 甘草丙二醇提取物的HPLC圖

圖5 甘草乙醇提取物的HPLC圖

圖6 甘草水提取物的HPLC圖

4 小結(jié)

本工作為科學(xué)合理地研究開發(fā)中藥烏拉爾甘草有效成分在化妝品中的應(yīng)用提供了重要實驗依據(jù)。通過測定甘草不同溶劑提取物對酪氨酸酶相對抑制作用和對DPPH·自由基的清除率，綜合比較了甘草不同溶劑提取物的美白活性。研究結(jié)果表明，無論是對酪氨酸酶的抑制作用還是對DPPH·自由基的清除作用，甘草丙二醇提取物都表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢；甘草丙二醇提取物的美白活性明顯優(yōu)于甘草乙醇提取物和甘草水提取物。經(jīng)HPLC分析檢測結(jié)果表明，甘草丙二醇提取物中甘草苷和甘草酸的含量也明顯高于乙醇提取物和水提取物。本論文研究工作探索了丙二醇這一優(yōu)良的提取溶劑，為甘草有效成分的提取提供了一種新途徑，也為甘草丙二醇提取物在美白化妝品中的應(yīng)用提供了重要的支持和參考。