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    短柱八角中二萜類成分及其抗炎活性

    2019-01-25 07:31:24呂閃閃孫連娜
    中成藥 2019年1期
    關鍵詞:二萜柱層析石油醚

    陳 偉, 呂閃閃, 王 璇, 陳 程, 孫連娜?

    (1. 菏澤家政職業(yè)學院, 山東 菏澤274300; 2. 上海中醫(yī)藥大學中藥學院中藥炮制學教研室, 上海

    201203)

    二萜是一種廣泛存在于自然界的C20類化合物,具有抗菌消炎、 抗腫瘤、 抗氧化等生物活性[1]。八角屬木蘭科植物廣泛分布在東南亞地區(qū), 在我國主要見于云南、 廣東、 廣西[2], 短柱八角Illicium brevistylum A. C. Smith 是八角屬的一種, 以灌木為主[3-5], 具有祛風除濕、 治療關節(jié)痛等功效[6]。 課題組前期已證實短柱八角干皮部位具有較好的抗炎活性[7-9], 可用于關節(jié)炎的治療, 具備一定開發(fā)前景; 本實驗進一步對其中二萜類成分進行分離, 并對其抗炎作用進行研究, 旨在闡明其相關活性物質(zhì)。

    1 材料

    安捷倫6540 型四級桿串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司); AVANCE Ⅲ600 MHz 核磁共振儀(德國布魯克公司); WFH-201B 暗箱式紫外分析儀(上海馳唐實業(yè)有限公司)。 S03230G-A 反相填料(加拿大Silicycle 公司); Sephadex LH-20 (美國通用公司); DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibico公司); RP-18F254硅膠板(德國默克公司); GF254薄層硅膠(青島裕寶精細化工有限公司); 布洛芬(珠海嘉億生物科技有限公司)。 HEK293/NF-κBluc 細胞(上海哈靈生物科技有限公司)。 所用試劑均為分析純。

    短柱八角干皮由上海中醫(yī)藥大學孫連娜副教授2011 年10 月在廣西省金秀縣采集并鑒定為正品,其標本(編號IB1110) 保存在上海中醫(yī)藥大學中藥炮制教研室。

    2 提取分離

    短柱八角干燥干皮(10 kg) 按照常規(guī)提取與萃取流程分別得到石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇、 水部位[6]。 取石油醚部位300 g, 采用石油醚與乙酸乙酯混合體系進行溶解, 揮干溶劑后, 進行硅膠柱層析, 以不同比例的石油醚-乙酸乙酯(50 ∶1 ~1 ∶1) 及純乙酸乙酯進行梯度洗脫, TLC 檢測合并的6 個餾分(P1~P6)。 P1 (18.9 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-乙酸乙酯(30 ∶1 ~15 ∶1) 梯度洗脫, TLC 檢測合并得到4 個部位P1.1 ~P1.4,P1.2 (2.1 g) 經(jīng)ODS 柱層析, 水-甲醇(2 ∶8)洗脫, 得化合物1 (15 mg); P1.2 (5.8 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-丙酮(10 ∶1 ~2 ∶1) 梯度洗脫, 得 化 合 物2 (11 mg)、 3 (12.7 mg)。 P2(15.3 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-丙酮(20 ∶1 ~7 ∶1) 梯度洗脫, TLC 檢測合并得到3 個部位P2.1~P2.3, P2.2 (5.8 g) 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析, 二氯甲烷-甲醇(1 ∶1) 洗脫, 得化合物4(27 mg)、 5 (26 mg); P2.3 (6.8 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-丙酮 (3 ∶ 1) 洗脫, 得化合物6(23 mg)。 P3 (23.8 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-乙酸乙酯(10 ∶1 ~1 ∶1) 梯度洗脫, TLC 檢測合并得到5 個部位P3.1 ~P3.5, P3.2 (2.1 g) 經(jīng)ODS柱層析, 水-甲醇 (4 ∶ 6) 洗脫, 得化合物7(15 mg); P3.3 (2.8 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-丙酮(2 ∶1) 洗脫, 得化合物8 (26 mg); P3.4(1.7 g) 經(jīng)硅膠柱層析, 二氯甲烷-甲醇(3 ∶1)洗脫, 得化合物9 (15 mg)。

    3 結構鑒定

    化合物1: 白色粉末, ESI-MS m/z: 215 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 5.81 (1H,dd, J =10.6, 17.6 Hz, H-15), 5.32 (1H, dd, J =1.2, 5.4 Hz, H-7), 4.92 (1H, dd, J =1.2, 17.6 Hz, H-16a), 4.86 (1H, dd, J =1.2, 10.6 Hz, H-16b), 1.21 (3H, s, H-17), 0.91 (3H, s, H-19),0.9 (3H,s,H-20);13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:38.9 (C-1), 18.0 (C-2), 36.9 (C-3), 46.5 (C-4), 45.1 (C-5),25.3 (C-6),121.1 (C-7),135.8(C-8), 52.2 (C-9), 35.1 (C-10), 20.1 (C-11),36.8 (C-12), 37.1 (C-13), 47.1 (C-14), 150.4(C-15), 109.4 (C-16), 21.6 (C-17), 185.7 (C-18),17.2 (C-19),15.4 (C-20)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[10] 基本一致, 故鑒定為異海松酸。

    化合物2: 白色無定形粉末, ESI-MS m/z:301.4 [M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ:7.27 (1H, d, J =8.2 Hz, H-11), 7.12 (1H, dd,J =8.2, 2.0 Hz, H-12), 7.00 (1H, d, J =2.0 Hz,H-14), 3.05 (1H, t, J =17.2 Hz, H-7α), 2.99(1H, t, J =17.2 Hz, H-7β), 2.93 (1H, m, H-15), 1.62 (1H, dd, J =12.8, 3.8 Hz, H-1α),2.42 (1H, m, H-1β), 1.68 (1H, d, J =12.6 Hz,H-5), 1.93 (1H, m, H-6β), 1.83 (1H, m, H-2β), 1.20 (1H, m, H-3α), 2.36 (1H, m, H-3β), 1.75 (1H, m, H-2α), 1.67 (1H, m, H-6α), 1.40 (3H, s, H-18),1.34 (3H, brs, H-16),1.33 (3H, brs, H-17), 1.23 (3H, s, H-20);13CNMR (150 MHz, CDCl3) δ: 37.9 (C-1), 18.5 (C-2), 36.7 (C-3), 47.5 (C-4), 54.5 (C-5), 21.7(C-6), 29.9 (C-7), 134.6 (C-8), 146.7 (C-9),36.8 (C-10),124.0 (C-11),123.8 (C-12),145.6(C-13), 126.8 (C-14), 33.4 (C-15), 24.0 (C-16), 24.0 (C-17), 185.7 (C-18), 16.1 (C-19),25.0 (C-20)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[11] 基本一致,故鑒定為脫氫樅酸。

    化合物3: 白色細針晶(丙酮), ESI-MS m/z:337 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 3.32(1H, d, J =5.6 Hz, 3-OH), 3.31 (1H, s, 16-OH),3.13 (1H, t, J =11.2 Hz, H-3),1.86 (2H,m, H-2), 1.62 (2H, m, H-15), 1.74 (1H, m,H-13), 1.23 (3H, s, H-17), 1.07 (3H, s, H -20), 0.91 (3H, s, H -18), 0.73 (3H, s, H-19);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ: 38.6 (C-1),27.6 (C-2), 76.2 (C-3), 38.4 (C-4), 57.8 (C-5), 19.2 (C-6), 42.4 (C-7), 38.6 (C-8), 55.1(C-9), 44.4 (C-10), 18.4 (C-11), 26.6 (C-12),47.4 (C-13), 38.6 (C -14), 57.8 (C-15), 77.8(C-16), 32.2 (C-17), 28.1 (C-18), 17.4 (C-19), 15.7 (C -20)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[12] 基本一致, 故鑒定為3, 16α-二羥基-貝殼杉烷。

    化合物4: 白色無定型粉末, ESI-MS m/z:299.2 [M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ:7.26 (1H, dd, J =8.4, 1.9 Hz, H-12), 7.21(1H, d, J =8.4 Hz, H-11), 7.14 (1H, s, H-14),5.33 (1H, s, H-16a),5.05 (1H, s, H-16b),2.94(1H, dd, J =16.8, 4.6 Hz, H-7a), 2.83 (1H, m,H-7b), 2.27 (1H, m, H-1b), 2.24 (1H, dd, J =13.6, 6.2 Hz, H-6a), 2.22 (1H, m, H-3b), 2.15(1H, m, H-6b), 2.13 (3H, s, H-17), 1.98 (1H,m, H-2b), 1.58 (1H, m, H-2a), 1.52 (1H, m,H-5), 1.47 (1H, m, H-1a),1.30 (3H, s, H-18),1.24 (3H, s, H-20), 1.12 (1H, m, H-3a);13CNMR (150 MHz, CDCl3) δ: 38.3 (C-1), 17.6 (C-2), 40.8 (C-3), 50.1 (C-4), 46.1 (C-5), 19.9(C-6), 19.8 (C-7), 128.8 (C-8), 139.1 (C-9),40.3 (C-10),119.3 (C-11),123.2 (C-12),138.4(C-13), 126.2 (C-14), 148.8 (C-15), 111.0 (C-16), 21.1 (C-17), 25.1 (C-18), 185.3 (C-19),16.4 (C-20)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[13] 基本一致,故鑒定為8, 11, 13, 15-abietatetraen-19-oic acid。

    化合物5: 白色無定形粉末, ESI-MS m/z:315.14 [M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ:7.70 (1H, dd, J =8.4,1.8 Hz, H-12),7.64 (1H,d, J =1.8 Hz, H-14),7.34 (1H, d, J =8.4 Hz, H-11), 3.68 (3H, s, H-OCH3), 2.56 (3H, s, H-17), 2.96 (2H, m, H-7), 2.34 (1H, t, J =12.0,3.0 Hz, H-1β), 2.23 (2H, dd, J =12.6, 3.0 Hz,H-5), 1.86 (1H, m, H-6β),1.78 (2H, m, H-2),1.71 (2H, m, H-3), 1.56 (1H, m, H-6α), 1.50(1H, m, H-1α), 1.29 (3H, s, H-19), 1.22 (3H,s, H-20);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ: 18.47(C-2), 36.6 (C-3), 47.7 (C-4), 44.5 (C-5),21.4 (C-6), 29.9 (C-7), 135.5 (C-8), 154.95(C-9), 37.8 (C-10), 124.6 (C-11), 125.9 (C-12),134.6 (C-13),129.4 (C-14),198.1 (C-15),29.7 (C-16), 26.55 (C-17), 178.9 (C-18), 16.5(C-19), 24.8 (C-20), 52.0 (C-OCH3)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[14] 基本一致, 故鑒定為methyl-16-nor-15-oxodehydroabietate。

    化合物6: 無色油狀物, ESI-MS m/z: 317.2[M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 6.84(1H, s, H-14), 6.63 (1H, s, H-11), 3.13 (1H,m, H-15), 2.83 (2H, m, H-7), 2.23 (1H, d, J =1.8 Hz, H-5), 1.56 (1H, dd, J =12.8, 3.8 Hz,H-1α), 2.19 (1H, m, H-1β), 1.84 (2H, m, H-3), 1.83 (2H, m, H-6), 1.53 (2H, m, H-2),1.28 (3H, s, H-19), 1.24 (3H, d, J =6.6 Hz, H-16), 1.23 (3H, d, J =6.6 Hz, H-17), 1.20 (3H,s, H-20);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ: 36.8 (C-1), 18.5 (C-2), 36.7 (C-3), 47.4 (C-4), 44.5(C-5), 21.8 (C-6), 29.2 (C-7), 127.0 (C-8),147.7 (C-9), 37.8 (C-10), 110.8 (C-11), 150.6(C-12), 131.8 (C-13), 126.7 (C-14), 26.7 (C-15), 22.5 (C-16), 22.7 (C-17), 185.1 (C-18),16.2 (C-19), 24.9 (C-20)。 以 上數(shù)據(jù)與文獻[15] 基本一致, 故鑒定為12-羥基-脫氫樅酸。

    化合物7: 白色晶體(甲醇), ESI-MS m/z:317.1 [M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ:4.86 (1H, d, J =1.6 Hz, H-16α), 4.84 (1H, d,J =1.6 Hz, H-16β), 4.72 (1H, d, J =1.6 Hz, H-18α), 4.68 (1H, d, J =1.6 Hz, H-18β), 1.08(3H, s, H-19), 1.38 (3H, s, H-20),1.74 (3H,s, H-17);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ:25.8 (C-1), 34.6 (C-2), 173.4 (C-3), 149.6 (C-4),41.6 (C-5), 17.6 (C-6), 24.3 (C-7), 129.4 (C-8), 128.9 (C-9), 41.4 (C-10), 40.7 (C-11),38.2 (C-12), 44.6 (C-13), 34.7 (C-14), 145.4(C-15), 112.8 (C-16), 28.3 (C-17), 103.1 (C-18), 15.8 (C-19),17.8 (C-20),50.1 (C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12] 基本一致, 故鑒定為3, 4-開環(huán)海松烷-4, 8 (9), 15 (18) -三烯-3-酸甲酯。

    化合 物8: ESI-MS m/z: 331 [M +H]+。1HNMR (600 MHz, CDCl3) δ: 7.27 (1H, d, J =8.2 Hz, H-11), 7.21 (1H, dd, J =8.2, 2.0 Hz, H-12), 7.15 (1H, d, J =2.0 Hz, H-14), 3.66 (3H,s, H-OCH3), 2.91 (1H, t, J =17.2 Hz, H-7b),2.89 (1H, m, H-15), 2.32 (1H, m, H-1β), 2.30(1H, dd, J =12.6, 2.2 Hz, H-5), 2.24 (1H, m,H-6β), 2.22 (1H, m, H-2β), 1.78 (1H, m, H-3α), 1.66 (1H, m, H-2α), 1.70 (1H, m, H-3α), 1.67 (1H, m, H-6α), 1.55 (6H, s, H-16/17), 1.49 (1H, m, H-1α), 1.29 (3H, s, H-19),1.21 (3H, s, H-20);13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ:38.0 (C-1),18.6 (C-2),36.7 (C-3),47.7 (C-4), 44.9 (C-5), 21.7 (C-6), 30.2 (C-7), 134.7(C-8), 147.9 (C-9), 37.0 (C-10), 124.2 (C-11),122.1 (C-12),146.2 (C-13),124.9 (C-14),72.3 (C-15), 31.7 (C-16), 31.7 (C-17), 179.2(C-18), 25.1 (C-19), 16.6 (C-20), 52.0 (COCH3)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[16] 基本一致, 故鑒定為15-羥基取代松香烷甲酯。

    化合物9: 白色無定型粉末, ESI-MS m/z:335.2 [M +H]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ:6.13 (1H, t, J =1.8 Hz, H-14), 1.28 (3H, s, H-19), 1.07 (3H, s, H-20), 0.97 (3H, d, J =4.2 Hz, H-17), 0.96 (3H, d, J =4.2 Hz, H-16);13CNMR (150 MHz, CDCl3) δ: 33.6 (C-1), 17.7 (C-2), 37.5 (C-3), 47.2 (C-4), 40.3 (C-5), 20.7(C-6), 27.5 (C-7), 143.9 (C-8), 82.3 (C-9),38.6 (C-10), 23.7 (C-11), 25.3 (C-12), 79.8(C-13), 127.2 (C-14), 32.3 (C-15), 17.6 (C-16), 17.3 (C-17), 183.9 (C-18), 17.7 (C-19),17.9 (C-20)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[17] 基本一致,故鑒定為9β, 13β-endoperoxide-abieta-8 (14) -en-18-oic acid。

    4 抗炎活性檢測

    293-NF-κB-luc 細胞轉(zhuǎn)至48 孔板(1×104/孔),采用含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,然后將細胞分為空白組(含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液)、 正常組(含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的293-NF-κB-luc 細胞)、 模型組(1 μg/mL LPS 刺激48 h, 含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的293-NF-κB-luc 細胞)、 給藥組(含有藥物、10%FBS 的DMEM 正常 培 養(yǎng)的293-NF-κB-luc 細胞, 同時加LPS 刺激48 h)、 陽性藥組 (含有10 μg/mL布洛芬、 10% FBS 的DMEM 正常培養(yǎng)的293-NF-κB-luc 細胞, 同時加LPS 刺激48 h)。

    將化合物4 ~6、 8 配制成3 mg/mL 溶液[6],PBS 稀釋成10 μg/mL, MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)上述化合物在10 μg/mL 時不影響細胞的正常生長, 因此后續(xù)均采用該質(zhì)量濃度考察抗炎活性。 將10 μg/mL化合物與細胞共同孵育 4 h 后, 加入 LPS(1 μg/mL) 再培養(yǎng)48 h, 檢測細胞上清液的熒光強度。

    實驗過程中, 化合物1 ~5、 7、 9 質(zhì)量較少,在保證為后期實驗存有對照品的基礎上, 課題組只對化合物4 ~6、 8 進行了抗炎活性檢測。結果表明, 三者均能降低LPS 誘導293-NF-κB-luc 的熒光強度, 其中5、 8 活性優(yōu)于陽性藥, 見表1。

    表1 各化合物抗炎活性(±s, n=3)Tab.1 Anti-inflammatory activities of various compounds(±s, n=3)

    表1 各化合物抗炎活性(±s, n=3)Tab.1 Anti-inflammatory activities of various compounds(±s, n=3)

    注:與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,??P<0.01

    組別 熒光強度正常組 356.66±9.01模型組 2 946.00±44.23#?;衔? 組 1 522.33±74.11??化合物5 組 894.67±18.88??化合物6 組 1 508.33±54.54??化合物8 組 575.67±24.79??陽性藥組 1 338.33±35.53??

    5 討論與結論

    本實驗從短柱八角中分得9 個二萜化合物, 其中化合物1、 7 為海松酸型二萜, 化合物3 為貝殼杉烷型二萜, 2、 4 ~6、 8 ~9 為松香烷二萜, 均為首次從該植物中分離得到, 其中3、 7 為首次從八角屬植物中分離得到。 藥理實驗顯示, 化合4 ~6、8 均具有較強的NF-κB 抑制活性, 表明松香烷二萜可能是短柱八角抗炎活性的代表成分, 可為其深入研究提供依據(jù)。

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