基因芯片技術(shù)在慢性乙型肝炎患者中耐藥基因檢測的應用情況

劉艷枚 楊夢 劉倩 周鵬 周美芳 尹衛(wèi)國 黃振勇 禤淑霞 李介華

作者單位：511500 清遠市人民醫(yī)院

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種雙鏈DNA病毒, 引起以肝臟病變?yōu)橹鞯囊倚透窝? 隨著疫苗大力推廣,世界范圍內(nèi)HBV感染增長速度明顯減慢, 但仍為我國最流行、危害最嚴重的一種傳染?。?］?？共《局委熓强刂坪皖A防慢性進展的唯一選擇, 4 類核苷和核苷酸類藥物(nucleoside and nucleotide analogs, NAs)是目前臨床治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的主要藥物, 但常發(fā)生HBV對NAs的耐藥, 導致治療失敗和疾病進展［2］。本院引進一項用于HBV耐藥基因檢測項目, 采用基因芯片法檢測HBV常見8個耐藥位點, 本研究為更好的評價該項技術(shù)的靈敏度和特異性, 選用臨床常用Nas藥物LAM、ADV的3個常見耐藥位點rt204、rt181、rt236進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年1月～2016年8月來本院門急診就治的 210例CHB 患者, 入選條件：①符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB的診斷標準；②使用LAM或(和)ADV治療＞1年；③血清中存在乙肝e抗原(HBeAg)和乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA), 且通過實驗室確證患者血清樣本中HBV-DNA載量＞1.0×103 IU/ml, 均知情同意本研究, 經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準, 分離血清樣本放置-20℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 HBV耐藥突變基因檢測試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供, 主要檢測儀器有Life Express基因擴增儀、eppendorf高速離心機、FYY-3型分子雜交儀、BioBase生物安全柜, 一代測序篩選部分外送凱普生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 基因擴增 取 200 μl 血清, 經(jīng)過裂解液將 HBV-DNA釋放, 無水乙醇和W液洗滌, TE液溶解, 取5 μl基因產(chǎn)物進行聚合酶鏈式反應(PCR)反應, 反應條件為：50℃、95℃10 min ；94℃ 60 s, 68℃ 30 s , 30 循環(huán) ；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 30 s, 48 循環(huán) ；72℃ 5 min, 擴增完成。

1.2.3 基因芯片雜交 將擴增的DNA產(chǎn)物進行變性, 放入芯片上進行雜交, 芯片上包含rt204、rt181、rt 236位點的所有的野性型和突變型, 待芯片雜交完成后在光學分析儀上進行掃描。

1.3 觀察指標 ①測序法檢測基因突變結(jié)果；②基因芯片檢測的靈敏度、特異性。靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性),特異性=真陰性/(真陰性+假陽性),

2 結(jié)果

2.1 測序法檢測基因突變結(jié)果 210例CHB患者中, 測序法檢測出rt204位點突變者42例、檢出率為20.00%, rt181位點突變者24例、檢出率為11.43%, rt236位點突變者18例、檢出率為8.57%, 未發(fā)生突變者為126例。雖然CHB患者主要以LAM耐藥基因rt204位點突變?yōu)橹? 但是 ADV耐藥基因rt181、rt236也發(fā)生了一定程度上的突變(見表1, 圖1)。

2.2 基因芯片檢測的靈敏度、特異性 210例CHB患者中,基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)204位點突變者44例, 181位點突變者25例, 236位點突變者21例。基因芯片技術(shù)檢測HBV基因rt204位點突變的靈敏度為95.24%, 特異性為97.62%；rt181位點突變的靈敏度為91.67%, 特異性為98.39%；rt236位點突變的靈敏度為94.44%, 特異性為97.92%, 均達到高的靈敏度和特異性(見表1, 圖1)。

表1 兩種技術(shù)檢測HBV基因突變情況(n, n=210)

圖1 測序法檢測HBV耐藥基因圖注：該患者體內(nèi)HBV基因的rt204M位點突變?yōu)閞t204I

3 討論

臨床治療CHB主要采用核苷和核苷酸類藥物, 但在治療過程中很容易發(fā)生基因突變引起耐藥, 常用Nas藥物LAM, 在選擇性壓力下最常見HBV-DNA 聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)變異, 即由YMDD變異為YIDD(rtM204I)或YVDD(rtM204V), 使LAM與HBVDNA 聚合酶的親合力下降或消失, 變異的HBV逐漸成為對LAM耐藥的優(yōu)勢株。對于CHB患者, 耐藥是一個極為嚴重的打擊, 不僅增加發(fā)生肝功能失代償和肝細胞癌(HCC)的風險而加速疾病進展, 同時還會加大后續(xù)治療的難度, 增加長期治療的醫(yī)療成本［3,4］。

目前在臨床上對于耐藥基因的檢測尚無統(tǒng)一的規(guī)范［5,6］,PCR-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、肽核酸介導的PCR鉗制連接酶檢測反應、微陣列、質(zhì)譜分析等技術(shù), 高度可靠但耗時長, 需要熟練的技術(shù)人員來執(zhí)行［5-8］。直接HBV-DNA的測序被認為是檢測LAM、ADV耐藥HBV突變基因的金標準, 但它是一種耗時且費力的方法, 僅在突變病毒占病毒總數(shù)的至少25%時檢測突變病毒［9,10］。基因芯片是一項基于PCR技術(shù)和反向斑點印跡(RDB)法并同時檢測多個突變位點的技術(shù), 在rt204、rt181、rt236位點突變的靈敏度達到90%以上, 特異性甚至達到98%以上, 但有趣的是基因芯片法在rt204、rt181、rt236三個位點陽性檢出率均比測序法高, 可能的原因有其檢測線低, 可檢測出5%以上突變病毒, 靈敏度可能比直接測序法高。

綜上所述, 基因芯片技術(shù)作為一種操作簡單、高敏感和特異性分子生物學檢測技術(shù), 有望推廣成為HBV耐藥基因檢測的一種便捷、精準的檢測方法, 為廣大CHB患者提供及時、有效的耐藥監(jiān)測。